本文是来自Ambrx, Inc. 和3M的研究人员发表的文章“Single-stage chromatographic clarification of Chinese Hamster Ovary cell harvest reduces cost of protein production”的内容简介，详细内容，请参考原文。
使用一次性层析澄清装置 (CCD) 开发了单级澄清，以从中国仓鼠卵巢 (CHO) 收获细胞培养液 (HCCF) 中回收重组蛋白。 CHO HCCF 的澄清是一个复杂且昂贵的过程，涉及多个离心和/或深层过滤步骤，以去除细胞和碎片并减少工艺相关杂质，例如宿主细胞蛋白 (HCP)、核酸和脂质。使用深层过滤时，过滤器链由多个不同比例、层数、孔径和吸附特性的过滤器组成。深层过滤器与 0.2 微米膜过滤器相结合，基于尺寸排阻、吸附和基于电荷的机制澄清 HCCF，并提供强大的生物负荷控制。澄清过程的每个阶段都需要时间、劳动力和公用设施，每一步都会有产品损失。在这里，使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier（一种单级 CCD）被确定为三级过滤系列的替代策略。 CCD 导致总体过滤面积更小，冲洗体积更小，收率更高。使用生物工艺成本模型，将单级澄清工艺与三级过滤工艺进行了比较。通过将 CHO HCCF 澄清压缩到单级层析，澄清工艺的总成本降低了 17%-30%，具体取决于生物反应器规模。成本降低的主要驱动因素是总过滤面积、劳动力、时间和公用设施的减少。单级收获工艺的优势延伸到整个下游工艺，导致累积收率相对增加 25%，杂质清除率相当。
治疗性蛋白质，包括单克隆抗体 (mAb)、双特异性抗体、细胞因子和酶，通常使用补料分批或灌流哺乳动物细胞培养工艺生产，其中目标蛋白质由细胞表达和分泌。使用离心和/或深层过滤作为主要回收步骤从收获细胞培养液 (HCCF) 中回收目标蛋白，以去除细胞和细胞碎片，并减少工艺相关杂质，如宿主细胞蛋白、核酸、和脂质。
使用离心或深层过滤是一个特定于产品的决定，其中生产的规模和临床阶段（例如，I期或商业化）、资本设备、成本、可清洁性和设施（专用或多产品）等因素是经过考虑的。与连续流离心相比，深层过滤单元操作的开发没有那么复杂，这转化为可预测的放大和易用性。支持早期生产的多产品设施，如合同开发和制造组织 (CDMO)，依靠一次性深层过滤作为主要澄清步骤，最终提高设施的灵活性、产能和生产力。此外，与离心分离相比，一次性深层过滤显著减少了清洁验证要求以及因产品转换而导致的设施停机时间。
在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞表达的重组非抗体蛋白产品的 1 期临床生产工艺的开发过程中，开发了一种基线、两级深层过滤工艺，以从细胞培养液（CCF)中回收目标蛋白 (图 1A)。经过一系列正交层析分离，包括阳离子交换（CEX）、混合模式阴离子交换（MAX）、混合模式交换（MCX）、聚乙二醇化和进一步纯化，药物底物 (DS) 中残留的宿主细胞蛋白（HCP）水平约为 200 ng HCP/mg 产品。使用沉淀助剂、洗涤缓冲液添加物、填料筛选（疏水相互作用层析 (HIC)、阴离子交换 (AEX)、阳离子交换 (CEX) 和混合模式 (MM)）探索了其它 HCP 降低策略，结果几乎没有进一步减少 HCP 的效果。
基于 AEX 纤维层析技术的一次性澄清装置（3M Emphaze AEX Hybrid Purifier）作为 HCCF 澄清系列的第三级引入，导致 HCP 水平额外降低 50%（图 1B）。初级、二级和三级澄清阶段串联操作，正面表面积比为 3:3:1。纯化和聚乙二醇化后，在药物物质 (DS) 中测得的 HCP 水平约为 10 ng HCP/mg 产品，表明层析澄清阶段相对于两级深层过滤系列提供了额外的 1.3 LRV。
最近，出现了一种新的解决方案，它采用纤维层析法高效且可放大地去除细胞、细胞碎片和关键的可溶性污染物。 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier是一种单级层析澄清装置 (CCD)，由 AEX 季铵 (Q) 配体功能化聚丙烯纤维床和 0.2 um 膜组成。在细胞培养澄清过程中，细胞和细胞碎片静电结合到 AEX 纤维上，从而有效保留大颗粒和小颗粒，而不会形成表面饼层。与离心或传统深层过滤相比，带电纤维介质还能够有效去除与可溶性工艺相关的杂质（即宿主细胞蛋白质和核酸），从而产生更清洁的流出物。 CCD 的推荐工作压差为 ≤5 psi，从而减少细胞剪切和裂解，进一步提高 HCCF 的质量并最大限度地减少二硫化物还原的可能性。此外，与传统的湿法深层过滤介质相比，CCD 的合成 AEX 介质在使用前需要更少的冲洗，从而节省了公用设施和时间。此外，水用作 CCD 冲洗液，因此无需缓冲液制备和相关缓冲液批记录的质量放行。
考虑到使用三级链有效澄清和去除 HCP 和 DNA，开发了单级澄清作为直接替代，利用 CCD 的物理和静电特性有效去除细胞、HCP 和 DNA（图 1C）。基于这些结果，细胞培养澄清步骤所需的总过滤面积减少了 2.5 倍。纯化和聚乙二醇化后，整个工艺过程的产量增加了约 25%，同时所有产品质量属性均符合验收标准，并与三级过滤器链相当。
对细胞培养澄清步骤的生产成本进行建模，以使用三级与单级澄清方法的所有相关输入来评估成本和节省。通过将 CHO 细胞培养的澄清压缩到一级，澄清工艺的总成本降低了 17%-30%，具体取决于规模（例如，生物反应器体积）。成本降低的主要驱动因素是总过滤面积、劳动力和公用设施使用量的减少。随着单级层析澄清工艺的实施，细胞培养澄清的总时间，包括准备（纤维床冲洗和平衡）、产品过滤和洗涤，减少了大约 50%。
详细试验操作、结果和讨论，请参考原文。
图 1. 生产非抗体蛋白产品的工艺流程。 (a) 使用 3M Zeta Plus Filter Capsules 10SPO2A 和 90ZBO5A 进行两级深层过滤，(b) 使用 Zeta Plus Filter Capsules 10SPO2A 和 9OZBO5A 以及 3M Emphaze AEX Hybrid Purifier进行三级过滤，以及 (C) 单级层析澄清使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier。澄清后，所有链均通过相同的下游纯化单元操作进行处理：结合-洗脱阳离子交换层析、流穿混合模式阴离子交换层析、结合-洗脱混合模式阳离子交换层析、聚乙二醇化以及结合-洗脱阳离子交换层析。
图 2. 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier经过 SEM 制备步骤（例如固定、脱水、临界点干燥和金溅射涂层）后的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。在澄清前 (a,b) 和 HCCF 澄清后 (c, d) 从装置中提取纤维介质层。 (a) 和 (c) 中的红色框分别表示 (b) 和 (d) 的放大图像。
图 3. (a) 链1-4 HCCF 的非还原 SDS-PAGE。 (b) 链 1-4 的 HCCF 的宿主细胞蛋白 (HCP) 分析。
图 4. 三级过滤（链 3）和使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier（链5）的单级层析澄清的压差曲线。
图5. 链2、链3和链5的细胞培养起始材料以及澄清滤液样品的浊度(NTU)值(未酸化和酸化)。
图6. 来自不同收获策略（链1-5）的 (a) 宿主细胞蛋白 (HCP) 水平和 (b) 工艺中间体的累积产量。
图7. (a) 单次运行不同体积生物反应器时，单级澄清 (链 5) 与三级澄清 (链 3) 相比节省的运行成本 (过滤器、人工、水和管路) 节省百分比。(b) 总费用节约，包括资本设备 (操作费用和过滤器支架)，与不同生物反应器体积下批次数的关系。
图8. 不同生物反应器体积下单级和三级澄清工艺纯化原料药每克标准化成本 (数据归一化为200L三级澄清)。
总结
将澄清单元操作压缩到单级 CCD 可降低细胞培养澄清步骤的成本，减少与工艺相关的杂质（HCP 和 DNA），并提高生产率。单次运行的运营成本节省减少了 17-30%，具体取决于生物反应器规模。考虑到资本设备的成本，200 L和 2000 L生物反应器在 100 个批次后的总体成本节约分别为 29% 和 19%。在细胞培养澄清阶段（链3和链5）增加的 HCP 减少量减少了层析单元操作的负担，并在工艺过程结束时转化为更低的 HCP 水平。层析澄清（链3和链5）导致两个工艺的 HCP 水平（10 ng HCP/mg 产品）完全符合规格（低于 100 ng HCP/mg 产品）。通过强化细胞培养澄清步骤，与三级工艺相比，总体相对收率增加了 25%。因此，每克纯化原料药的澄清步骤成本降低了 40%。单级 CCD 已成功放大用于 GMP 生产，并产生与实验室规模相当的收率和 HCP 水平。
原文：B.O'Mara, N.K.Singh, A. Menendez., Single-stage chromatographic clarification of Chinese Hamster Ovary cell harvest reduces cost of protein production. Biotechnology Progress, 2023.
