稳健的细胞截留装置是成功进行细胞灌流培养的关键。目前，切向流过滤 (TFF，也称错流过滤) 和交替式切向流过滤 (ATF) 最常用于此目的。然而，TFF 的污染缓解能力较差，这会导致高过滤阻力以及产品截留，而 ATF 受限于停留时间长以及细胞积聚。在这项工作中，我们提出了一种用于交替式切向流过滤的过滤系统，它充分利用了交替流的污染缓解效果并减少了细胞积聚。我们测试了这种新颖的设置，并与 XCell ATF® 以及 TFF 进行了直接比较，模式料液包含酵母细胞和作为蛋白质的牛血清白蛋白，以模拟严苛的进样流速和滤液条件。我们发现，通过避免隔膜泵的死端设计，所提出的过滤系统的过滤阻力降低了大约 20% 到 30%（取决于进料速率和滤液流速）。通过优化阶段持续时间和流速控制，实现了新设置的进一步改进，这促使工艺持续时间延长四倍，直到发生中空纤维流道堵塞。因此，所提出的概念似乎优于目前灌流技术中的细胞截留装置。

在过去几十年中，灌流工艺在生物制药细胞培养工艺和类似研究中变得越来越重要，因为与补料分批工艺相比，灌流工艺提高了生产率，提高了产品质量，并且批次间的均质性更高。这一关键点通常可通过灌流或细胞截留装置实现，其设计用于在较长的工艺时间内、以连续生产模式分离生产的生物治疗物质，同时截留生产细胞。在基于膜的灌流装置中，通常使用常规切向流过滤（TFF）和交替式切向流过滤（ATF），即具有周期性改变流动方向的交错液流。在基于膜的灌流工艺中，一个关键的工艺性能指标是目标分子的滤过传输（也称为产物筛分）。与干净的膜相比，由截留的细胞和大分子形成的沉积物可以增加额外的截留效果。这种沉积物的形成通常会导致传输减少，因为它充当了由其自身形成的二级膜，且通常呈现不可预测的截留特性。已发表的工作表明 ATF 在实现更高的细胞活性和更低的产物截留方面优于 TFF。通过开发商用 XCell ATF® 设备，ATF 概念已广泛应用于生物制药行业。除了在单克隆抗体生产中用作灌流装置之外，它还被研究用于病毒颗粒的生产、强化 N-1 接种液制备以及生物药的收获。

XCell ATF® 装置与传统 TFF 相比的卓越性能归因于三个主要效果：首先，该系统中使用的进料泵 - 隔膜泵被认为是低剪切泵。据报道，使用低剪切泵可减少细胞损伤，从而减少 DNA、RNA 和其它细胞内物质释放到培养液中。这降低了水相中物质的复杂性，从而降低了污染倾向，否则会增加过滤阻力和产物截留。其次，据报道，这些污染效应可以通过液流方向反转和相关的压力脉动得到更好的控制，从而促进污染缓解，继而提高过滤性能。第三，据报道，不稳定液流的压力条件变化会导致滤液反冲截留物，也称为 Starling 流动现象，有助于从膜表面去除沉积物质。交替错流的污染缓解效果和其它流体动力污染缓解技术已在多部著作中得到广泛描述。

不过，在我们看来，剩下的关键点是 XCell ATF® 设备中应用的隔膜泵在操作灵活性、长期工艺处理和工艺条件的技术可行范围方面受到限制。此外，目前只能通过并行操作多个单元来放大 XCell ATF® 10（最大的商用设备）。隔膜泵通过从隔膜的反面供应压缩空气和真空来气动驱动，这实现料液从隔膜泵流回进料容器（压力阶段）和从进料容器进入隔膜泵（排气阶段），然而，使用压缩空气和真空会导致可达到的流速较小，例如在 XCell ATF® 4 设备中的最大值为 10 L/min，这导致所连接的中空纤维中的错流速度仅为 0.25 m/s。因此，沿膜或沉积物表面的壁剪切应力被限制在仅发生边际沉积物去除和污染缓解的水平。在剪切敏感细胞或菌丝体样聚体的灌流过程中，低错流速度是合理的，甚至是首选，但对于使用更稳健的细胞（例如毕赤酵母）的其它工艺，可能需要更高的错流速度来增强沉积层移动。多项专利提出通过使用两个隔膜而不是一个隔膜、电动致动器、活塞或它们的组合来改进 XCell ATF® 装置。然而，这些技术发展似乎在机械上实施起来很复杂，而且目前还没有商业化。

另一个重要方面是隔膜泵体积限制了泵每个冲程和循环的最大排量。因此，交替流的每个正向和反向循环的持续时间取决于目标流速。这种相互依赖性限制了工艺优化的选择，因为频率和错流速度都会影响污染和污垢缓解的程度。例如，如果降低错流速度、以减少作用在细胞上的剪切应力，也将减少频率，这可能对有效减轻污染产生负面影响。此外，生物反应器和过滤器组件的传输管线中的滞留体积相对于固定的泵排量的比率也可以看作是不利的。这是因为它会导致细胞在设备中停留时间过长，从而导致氧气耗尽、乳酸产量增加以及生长速度降低、活性受损和生产力降低。在某些工艺条件下，细胞甚至会积聚在隔膜泵滞留体积中，导致流体粘度增加，使所有上述缺点加剧，这与停留时间有关。这就是为什么一项专利建议用双向蠕动泵代替隔膜泵。然而，使用蠕动泵输送细胞培养液会对细胞造成不必要的剪切应力，因此对于哺乳动物细胞灌流培养而言并不是最佳选择.

考虑到所报告的交替式切向流过滤的优势，并为了克服上述问题，需要一种机械上简单且更加通用的交替流设置，能够在广泛的流速和流动反转频率范围内产生交替流。同时，应仅对细胞施加低剪切应力，减少生物反应器外的停留时间，并应避免细胞在外部回路中的积累。因此，在这项工作中，我们研究了一种新开发的替代式交替流概念，主要基于应用另一种泵概念，其中可以快速反应的离心泵在相反的流动方向上起作用（以下称为设置 II），并将其与 XCell ATF® 装置（在下面设置 I）进行了比较。在方法部分详细描述了所用泵的技术特征。

这项工作的重点是流体动力学条件，即两种过滤装置的流速、压力条件、过滤阻力和细胞积累效应。研究设计了一种可行的模式进样料液系统，其中包括作为生产细胞代表的酵母细胞和作为生产生物质替代物的牛血清白蛋白 (BSA)，后者通过膜。在开发新的细胞截留装置时，应用于细胞培养灌流工艺必须是最终目标。在这个阶段的工作中，重点是所提出概念的水动力特性。据报道，设置 II 中采用的泵的低剪切设计对哺乳动物细胞没有明显的破坏作用。因此，这项工作之后的下一步是将这一概念转移到哺乳动物灌流培养中并评估其对细胞活性的影响，包括细胞大小和细胞代谢，以及对产物筛分和产物质量的影响。

通过将滤液循环回进料罐，在两种装置中以恒定浓度模式在不同的流动条件下进行过滤实验。设置 II 首先在设置 I 可行的工艺条件范围内运行，以便对两者进行直接比较。然而，设置 II 具有更广泛的可能工艺条件，允许优化以克服上述细胞积累问题。有意选择较高的滤液速率，以引发污染和细胞积累现象，从而更好地区分两种技术设置。然后，在超出设置 I 限制的条件下进一步优化设置 II。流速和压力的在线数据采集以及过滤系统中不同采样点的定期采样与离线分析相结合，作为评估过滤性能和工艺稳健性的数据基础。

过滤系统

所有过滤试验均采用两种能够产生交替流的不同过滤系统中的任何一种进行（参见图 1，两种设置的简化 P&I 图）。设置 I 使用 XCell ATF® 4 设备。此设置中的交替流由隔膜泵产生，隔膜泵位于过滤器组件底端的截留侧。隔膜本身由压缩空气和真空驱动，由 ATF C24U v2.0 控制器控制。每冲程输送的泵体积为 400 ml。过滤组件和连接管的滞留体积约为 260 ml。当隔膜在排气阶段向下移动时，新鲜进料被吸入过滤组件。当隔膜在压力阶段向上移动时，排出的体积被推回到进料罐中。泵排量与 XCell ATF® 装置产生的进料流速与每个正向和反向阶段的循环时间有着千丝万缕的联系。XCell ATF® 4 支持 1 到 10 L/min 之间的进料流量。

两种不同过滤设置的简化 P&I 图，分别含有一个 XCell ATF® 4 设备（设置 I – 图 A）或2个带有磁悬浮叶轮的相反作用的离心泵（设置 II – 图 B），用于产生交替流条件。

设置 II 使用两个相反作用离心泵，PuraLev® i100SU（Levitronix），由控制台 LCO-i100控制以产生交替液流方向。这些泵的叶轮由磁力驱动并主动磁力悬浮。因此，避免了狭窄的间隙，后者会导致作用在细胞上的高剪切力。这就是为什么这些泵甚至适用于对剪切敏感的哺乳动物细胞灌流培养。两个泵分别位于过滤器组件的每一侧，并且流向均指向组件。当组件入口（定义为组件的底端）处的泵处于活动状态并且进料向前流动时，组件出口处（组件的顶端）处的第二个泵处于非活动状态，因此回流液流过没有显著流动阻力的停用泵。由于离心泵的无轴承设计，停用泵的压力损失可以忽略不计。在正向阶段结束时，底部泵被设置为非活动状态，顶部泵被设置为活动模式，这导致了流动逆转。由于其无轴承设计，这些泵可以快速启动和关闭，从而产生陡峭的、几乎是阶梯式的流量分布。这些泵还可以承受流速和方向的频繁变化所造成的流体动力应力。给定设置中的最大流速在任一方向上均为 14 L/min。前进和后退阶段的持续时间可以独立于流速选择。

除了产生交替流动的泵外，这两个装置具有相同的主要部件。使用最大工作体积为 15L 的温控搅拌罐生物反应器 Biostat Cplus（Sartorius）。

使用的过滤器组件（F4：RF05PES，Repligen）长 35.8 cm（有效纤维长度为 29.5 cm）。它由 830 根由聚醚砜 (PES) 制成的中空纤维组成，内径为 1mm，有效膜面积为 0.77m2，回流空腔体积为 234ml。膜的标称孔径为 0.5 μm。

渗液由双头蠕动泵（Heidolph Pumpdrive 5001）抽取并循环至进料罐。进料、回流和滤液管线配备有压力传感器（PendoTECH）。滤液流量用超声波高精度流量计 LFS-03SU-Z-SC1（Levitronix）测量，进料流量用超声波外夹式流量计 LFSC-i16X（Levitronix）测量，其特点是在两个流动方向上都能进行精确测量。设置 II 的回流管线配备了额外的超声波外夹式流量计 LFSC-12D。在这两种设置中，所有传感器都连接到控制台 LCO-i100。在线数据使用 Levitronix Service Software V2.0.7.3每秒收集一个数据点。在设置 I 的流量趋势表征及其在设置 II 中的再现的初步实验中，使用 LabVIEW 应用程序记录进料流量，以便以每秒大约 60 个数据点检索高分辨率数据。

详细的实验设置、结果与讨论，请参考原文。

标称错流为 4 L/min 的过滤运行的工艺性能指标：(a) 跨膜压力，(b) 过滤阻力，(c) BSA 传输，(d) 回流液中的干物质含量。深灰色圆圈表示设置 I，黑色菱形表示设置 II，浅灰色方块表示在设置 II 的一个离心泵处于活动状态的情况下进行的常规非交替错流运行。带实线的实心符号表示 400 ml/min 的滤液体积流量，带虚线的空心符号表示 200 ml/min。

滤液与进料比为 1:10 的过滤运行的工艺性能指标：(a) 跨膜压力，(b) 过滤阻力，(c) BSA 传输，(d) 回流液中的干物质含量。深灰色圆圈表示设置 I，黑色菱形表示设置 II。实线实心符号表示 4 L/min 进料体积流量和 400 ml/min 滤液体积流量，虚线空心符号表示 2 L/min 进料体积流量以及 200 ml/min 滤液体积流量。

标称错流为 2 L/min 且标称滤液流量为 400 ml/min 的过滤运行的工艺性能指标：(a) 实际平均进料流量，(b) 回流液中的干物质含量，(c ) 平均跨膜压，(d) 平均过滤阻力。深灰色圆圈指的是设置 I，黑色菱形设置 II 和浅灰色方块代表在设置 II 的一个离心泵处于活动状态的情况下进行的常规非交替错流运行。黑色矩形代表设置 II 的过滤试验，但向前和向后阶段延长，黑色星号代表设置 II 的过滤试验，其中泵受流量控制而不是速度控制。误差条表示随机重复的范围。

总结

在这项工作中，提出了一种新的交替错流过滤技术概念，并通过与最先进的 XCell ATF® 装置和传统的非交替错流过滤直接比较来研究其流体动力学性能。

与 XCell ATF® 相比，两个相反作用离心泵代替单个双向隔膜泵在较低的细胞积累和较低的过滤阻力方面提高了工艺性能。以前在高错流速度和高跨膜压力下显示的交替流的污染缓解效果可以在低错流速度和低跨膜压力条件下得到证实。这是在与传统非交替错流的直接比较中完成的，没有其它情况的额外影响，例如不同的剪切力，就像大多数直接 TFF vs. ATF 比较的情况一样。根据这项工作中提出的结果，交替错流过滤概念的替代设计可以提供额外的方法，在受膜污染影响较小的条件下进行细胞灌流培养，并在必须更换膜之前进行更长时间的可持续培养。本工作中提出的细胞截留装置已被项目合作伙伴成功应用于哺乳动物灌流培养，但详细讨论这些结果将超出本工作的范围。进一步的技术优化工作可以侧重于更广泛的处理条件，并且可以根据此处介绍的工作考虑对其它细胞系统的效果进行验证。