亲和层析填料必须在温和的洗脱条件下表现良好，同时经得起严格的清洗和消毒程序。
亲和层析是一种强大的分离技术，用于从复杂且具有挑战性的进料流中捕获目标产物，这使其成为病毒载体纯化的理想选择。然而，大多数病毒载体收获液含有低滴度的病毒载体和相对较高的杂质水平，这对亲和填料性能提出了很高的要求。病毒载体的敏感性及其在粒径大小和其它特征方面的可变性增加了与亲和层析工艺开发相关的挑战，包括选择正确的层析基质（填料/整体柱/膜/纤维）和配基。
敏感性和粒径问题
与包括重组蛋白和抗体在内的传统生物药物物质不同，病毒载体对高 pH 值和低 pH 值、高盐浓度和低盐浓度以及高剪切环境高度敏感。
Astrea Bioseparations 的细胞和基因治疗主题专家 Ian Scanlon 指出：“这种不稳定性是病毒载体的一大区别，并且在开发用于生产亲和层析填料的有效亲和配基方面提出了一些挑战”。更具体地说，亲和配基需要对目标病毒载体具有良好的结合行为，同时具有相对温和的洗脱条件，以避免在工艺过程中可能导致病毒颗粒感染性丧失的 pH 值变化，据 Sartorius 工艺技术顾问经理 Piergiuseppe Nestola 说。
此外，根据 Nestola 的说法，不同类型的病毒载体具有不同的大小，从 20 到 200 nm，一些溶瘤病毒载体甚至更大。“病毒粒径以反比关系影响亲和填料的动态结合载量 (DBC)。因此，对于更大的病毒载体，需要更大的柱-亲和层析系统，从而导致单元操作的总体成本增加，”他说。
根据Thermo Fisher Scientific 生物生产集团业务部门负责人 Laurens Sierkstra 的说法，一些病毒载体，特别是腺相关病毒 (AAV) 载体，通常以混合物的形式形成，其中一些包含完整的遗传物质，而另一些则不含或含有部分甚至不正确（例如宿主细胞）DNA。
消毒和清洗方面的挑战
Scanlon 补充说，一些病毒载体的大小和敏感性也会对去除生物负荷产生问题，尤其是病毒清除，因为通常不能使用 0.22 µM 过滤。“因此，清洗和消毒用于亲和捕获的吸附基质的重要性增加了，”他指出。这可能会有问题，因为一些用作亲和配基的蛋白质和肽与在线灭菌 (SIP) 方案不兼容。
有限的商业化产品
通常，病毒载体的亲和层析只有在商业上可行的配基可用时才能进行，Nestola 评论道。直到最近，只有设计用于腺相关病毒 (AAV) 载体纯化的亲和层析填料的配基可用。用于纯化慢病毒 (LV) 载体的新型填料现已上市（见下文）。
根据 Scanlon 的说法，亲和层析填料商业化的一个挑战与相对于市售吸附基质孔径大小的病毒载体粒径有关。“目前的产品通常是为抗体的最佳工艺而设计的 - 通常在 10-15 nm左右。许多病毒载体较大（约 90-100nm 的腺病毒、约 80-100nm 的γ - 逆转录病毒和慢病毒），因此无法进入孔内的结合表面。因此，对这些较大的目标产物实施基于基球的方法可能会产生较低的产能，”他解释道。
另一个困难是亲和填料通常必须特定于给定的病毒载体（例如 LV 与 AAV 载体），并且在 AAV 的情况下，特定的血清型（AAV2、AAV8、AAV9 等）。LV 载体是囊膜病毒，而 AAV 载体是无囊膜病毒。“一般来说，无囊膜病毒比有囊膜病毒更稳定、更具抵抗力，这意味着从层析条件的角度来看，LV 载体的洗脱条件和剪切应力比 AAV 更重要，”Sierkstra 指出。此外，虽然空衣壳/完整衣壳比例是 AAV 载体的一个问题，但对于像 LV 载体这样的囊膜病毒，产生大量非感染性慢病毒类似颗粒（例如外泌体）也会带来纯化困难，她补充道。
“这意味着此类填料的应用不太灵活，病毒载体制造商很难使用单一亲和层析填料为一系列载体构建平台纯化工艺，”Nestola 说。
此外，虽然市场上有 AAV 血清型特异性和非特异性亲和层析产品，但并非所有血清型都能很好地与亲和配基结合。“因此，对于每种血清型，都应进行优化和筛选，以找到对特定血清型具有最佳亲和力的配基/填料，”Nestola 指出。
根据 Nestola 的说法，使情况复杂化的是病毒载体领域的不断演变。例如，他指出正在开发新的 AAV 血清型或嵌合体血清型，它们不与现有的现成亲和配基结合。出于这个原因，Scanlon 观察到，制造商正在放弃当前的亲和方法，并返回到基于电荷的平台化方法。“虽然可能需要更多的精纯步骤来减少工艺相关杂质，但这种平台方法具有与 SIP 和在线清洗 (CIP) 工艺兼容、跨血清型的灵活性以及降低成本的优势，”他说。
几个重要的亲和填料属性
与任何其它亲和层析填料一样，与病毒载体一起使用的填料应该允许以高流速清除杂质，以减少纯化时间，从而降低成本，并且在这种情况下，还可以避免感染性的丧失。这些目标必须在温和的洗脱条件下实现，Nestola 重申。根据 Sierkstra 的说法，用于病毒载体的亲和填料还必须易于规模放大，并具有适合所选病毒载体的正确内置属性。
据 Scanlon 称，必须去除的主要杂质包括宿主细胞 DNA 和其它核酸。外来病毒和工艺相关病毒也必须清除，这要求辅助病毒（如 AAV 工艺中的腺病毒）不结合至所用的亲和配基。
Scanlon 强调，考虑到病毒载体产品的滴度通常很低，在高上清液上样体积条件下将目标病毒与杂质进行稳健分离也很重要。他补充说，亲和填料的设计还必须能够承受 SIP 和 CIP 过程，而不会影响其性能，因为它们在去除生物负荷方面起着至关重要的作用。
筛选是根本
高通量筛选是开发用于病毒载体亲和层析的新型配基和开发给定载体产品的最佳亲和层析纯化工艺的最佳方法。
“基于噬菌体展示和基于文库的方法以及高通量工艺开发工具（例如液体处理和基于多孔板的筛选）允许筛选大量构建体和条件，以开发新型配基，”Scanlon 说。Thermo Fisher Scientific 使用病毒载体的特定属性作为采用质量源于设计方法的高通量开发的起点。“在初始筛选阶段，这项技术确保正在开发的配基能够在特定条件下以所需的特异性洗脱，”Sierkstra 说。
同时，根据 Nestola 的说法，亲和层析工艺条件的优化应从小规模筛选开始，通常使用 96 孔板来检查不同的配基/基质和缓冲液系统。“开发良好的缓冲液策略，使病毒载体产物与亲和填料良好结合，同时最大限度地减少病毒聚集，这一点至关重要，”他观察到。然后，通常在小规模设备 (1-5 mL) 上验证筛选，以确认筛选结果。
解决可放大性需要进一步的发展
对载体和血清型特异性亲和填料的需求为层析技术供应商提供了供应更多种类配基/基质解决方案的机会。“为包括但不限于 AAV 在内的几种病毒载体选择现成的配基将为该行业带来良好的利益，”Nestola 说。他补充说：“这种基质可以基于从抗体到抗体片段再到合成肽的各种类型的配基，从而为实现任何给定病毒载体的更高纯度和选择性提供了选择。”
Nestola 特别指出，随着更多利用病毒载体的基因和基因修饰细胞疗法实现商业化，对碱稳定性配基的需求只会增加，因为生产的批次数量呈指数级增长。他还观察到，应探索使用固定基球/填料以外的不同形式（例如，膜、整体柱）的亲和配基，以实现更快速地纯化不稳定的病毒载体产品。
Scanlon 表示同意，由于体积流速低，目前使用亲和填料进行大型病毒载体纯化的工艺时间很长，这直接影响商品成本。“工艺时间的任何减少都会导致成本降低并加快新疗法上市的速度，”他说。
根据每种病毒载体的具体需求，Sierkstra 认为，这些产品的改进将需要对其制造过程的各个方面进行持续的研发投资。例如，她指出了 AAV 载体在亲和捕获步骤之前通常需要的预处理步骤。“Thermo Fisher Scientific 开发了一种利用磁珠的纯化解决方案，为小规模工艺提供了一种更简单的方法，”她评论道。
一些新的解决方案已经进入市场
两家公司最近向市场推出了新的亲和填料 - 一套用于 AAV 载体，另一套解决方案专注于 LV 载体。Repligen 旗下公司 Avitide 开发了三种配基，专用于目前使用的主要 AAV 基因治疗载体（AAV2、AAV8 和 AAV9）。据该公司称，AVIPure 亲和层析填料在不牺牲高动态结合载量的情况下提高了碱稳定性。
后者来自 Thermo Fisher Scientific。CaptureSelect Lenti VSVG 亲和填料专为在温和洗脱条件下纯化 VSV-G 假型慢病毒颗粒而设计。该公司还提供 Poros CaptureSelect AAVX，一种适用于所有血清型 AAV 的填料。“开发这些产品是为了满足对平台纯化工艺和快速增长的临床管线的特定需求。以前的技术和解决方案缺乏特异性，常常导致纯化工艺涉及多个有时很复杂的步骤，增加了洁净室和生产时间，同时产量也很低，”Sierkstra 评论道。
bluebird bio 和合作者还提出肝素亲和层析作为纯化用于基因治疗应用的逆转录病毒载体的有效方法。
与此同时，Astrea Bioseparations 致力于开发一种用于病毒载体亲和层析的新型生物分离材料。据 Scanlon 称，AstreAdept 是一种静电纺丝复合纳米纤维层析膜，具有较大的开放结构，几乎可以瞬时结合大目标（包括病毒载体）到显著更大的结合表面积。“重要的是，”他强调说，“这种增加的载量不会受到纳米纤维的开放结构带来的高流速的影响，并且可以在没有在其它对流层析介质中观察到的压降的情况下运行。”
Nereus LentiHERO 是第一个采用 AstreAdept 技术的商业产品，于 2022 年 9 月推出，并针对实验室规模的 LV 颗粒初级捕获进行了优化。“这种新的非假型特异性亲和层析解决方案专门解决了传统生物分离工具的载量和工艺时间问题。它在生理 pH 值和盐浓度下运行，可保持 LV 颗粒的完整性和质量，并提供高结合载量和高回收率，从而从原料中获得更高的产量，”Scanlon 说。正在开发可规模放大的解决方案，以将该技术带入工艺规模。
原文：Challener, C.A.. Choosing the Right Resins for Viral Vector Affinity Chromatography. BioPharm International 2023 36 (1).
