①确定合适的细胞来源；
②生产出足够有效和安全的产品；
小鱼 | 作 者
BiG生物创新社 | 来 源
基因组编辑可以应用于单基因疾病。由编程基因组引起的双链断裂（DSB）通常通过人类细胞中的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复机制来解决。NHEJ通常导致目标基因组位点附近的插入或缺失，用于可编码的内源性遗传破坏。相比之下，在存在供体DNA模板的情况下，HDR可以精确替换基因组DNA，供体模板化以纠正与病理学相关的DNA。
图1：基因组编辑应用于单基因疾病
基于CRISPR-Cas的基因组编辑技术非常适合叠加使用，可用于改善细胞治疗方法，包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法。基于CRISPR-Cas9的多重基因组编辑（此处显示同时靶向编码人类β2-微球蛋白 （β2m），PD1和内源性T细胞受体（TCR））与慢病毒递送的CAR组合可改善CAR-T细胞的功能和安全性。
图2：多种基因组编辑改造CAR-T
具有灭活核酸酶活性的CRISPR-Cas系统不会导致双链断裂，但仍然可以精确地靶向基因组DNA。这些基于CRISPR-Cas的“表观基因组编辑”平台能够可靠地激活或抑制转录（分别为CRISPR激活（CRISPRa）或CRISPR干扰（CRISPRi）），或控制人类细胞内的表观遗传修饰。
图3：编辑表观基因组和基因表达
基因组和表观基因组编辑的可融合于细胞疗法，设计有利的特性，比如增强免疫相容性，产生同质细胞群，稳定CAR表达等。在细胞分化之前进行基因组编辑，这可能降低细胞疗法的生产成本并实现大规模生产。
图4:设计最优特性
合成生物学领域在过去二十年中已经出现，其目标是通过应用定量设计规则使基因工程结果可预测、可重复、更精确。该领域在微生物系统中取得了最早的突破，近年来在人类细胞工程方面也取得进展。通过精确控制治疗性转基因表达或分泌的治疗因子的递送，或者通过对细胞进行编程来感知与特定组织区室或疾病状态相关的生物分子，并改变细胞行为做出反应来增强细胞疗法。
图5：合成生物学方式
合成生物学未来的发展应包括开发人源性成分，开发更大容量的载体以适应更大，更复杂的路线，并使用合成路线来指导细胞分化（例如，从诱导多能干细胞分化成免疫效应细胞）。
图6：合成生物学挑战
下面介绍两例已经开发的合成生物学路线：
①CAR-T
通过对CAR活性的小分子远程控制来改善嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗并增强靶细胞特异性。遥控路线具有多个CAR，可用于通过施用小分子二聚体来重建CAR活性，从而实现对T细胞抗肿瘤功能的控制。
SynNotch是一种可编程的受体（第一个CAR），可以感知细胞表面配体并通过激活基因表达来做出反应。这种响应可以与第二个CAR的产生耦合，然后CAR能够识别第二个配体，从而实现“与门”功能。
图7 ：CAR-T合成生物学
②基因回路
设计自主治疗患病组织的合成sense and respond路线，其中炎症细胞因子的传感与抗炎细胞因子的分泌耦合。
图8：基因回路合成生物学
半透性生物材料和水凝胶已被用于改善治疗细胞的递送、活力、保留和安全性，但生物材料的作用远不止此。目前，限制细胞治疗产品开发的一大难题是，人体内免疫细胞对同源异体细胞的排斥作用。
幸运的是，生物材料有效地解决了这一难题。生物相容性聚合物的细胞封装提供了一种物理屏障，阻隔T细胞和自然杀伤（NK）细胞，使免疫细胞无法接触到异体治疗细胞，从而保持未活化状态。
图9：克服同种异体细胞治疗的免疫排斥反应的策略
使用供体细胞的移植技术需要长期保护免受异物反应和宿主识别。需要一个半透水凝胶网来允许小分子循环，如NO，活性氧（ROS），O2和细胞因子等，同时避免封装细胞之间的密切接触和这些植入物周围的免疫细胞浸润。已经采取了各种类型的化学方法来减轻异物反应并防止纤维化。
下面重点介绍2种更接近临床转化的技术：
①免疫调节小分子修饰的水凝胶
水凝胶表面已被免疫调节性小分子修饰，以防止任何异物反应。在基于海藻酸盐的水凝胶中使用小分子调节宿主免疫识别的化学修饰策略，已被证明有效。基于此开发了SIG-001，SIG-001是一种双室球体，具有表达因子VIII的工程细胞，最近进入了血友病A的首次人体临床试验。
②两性离子水凝胶
蛋白质吸收已被假定为宿主免疫激活和纤维化的关键因素。两性离子水凝胶产生超亲水生物界面，限制蛋白质吸收。最近，藻酸盐的两性离子磺基甜菜碱修饰已被证明可以减轻啮齿动物、狗和猪的异物反应，从而实现长期的胰岛免疫隔离。
图11：两性离子改性海藻酸盐微胶囊封装胰岛的示意图
协同工程方法最令人兴奋的贡献在于开发治疗管线，按需求定制设计路线，治疗各种适应症，有助于进一步扩大细胞治疗的临床范围和商业版图。
基因组和表观基因组编辑策略将继续用于改善细胞内在特性，对天然细胞进行全面的系统级重塑和细胞表型的改变，从而产生抗凋亡信号、高生存能力和增殖潜力，能够分泌更多治疗性蛋白质的产品。
合成生物学设计可以通过复杂的调节线路进行动态控制，从而增强自体细胞疗法。
生物材料的进步已经促进了多种同种异体封装细胞产品的开发，目前有几家公司正在推进用于Ⅰ型糖尿病，内分泌适应症和孤儿病临床阶段的封装细胞产品。
预计，基因编辑和合成生物学方面的创新，细胞封装概念的验证等将为细胞产品落地指明道路。细胞疗法发展前景光明，有望为新的适应症开发具有更长寿命和更强感知和反应能力的产品。
