对于在哺乳动物细胞中生产的药物产品，在生产过程中需要进行安全保证实践，以确保最终的药物产品是安全的，不会受到病毒污染的潜在风险。除病毒过滤器通过强大的、基于尺寸的截留机制针对一系列病毒提供病毒截留。因此，除病毒过滤步骤通常用于精心设计的重组治疗性蛋白纯化流程，并且是在生物技术产品生产过程中，将外源和内源性病毒颗粒风险降至最低的总体策略的关键组成部分。这篇综述总结了除病毒过滤的历史，目前可用的除病毒过滤器和预过滤器，以及除病毒过滤完整性测试方法和研究模型。还讨论了当前的理解和差距，并着眼于未来趋势和新兴过滤技术。
完整性测试
一个关键的过程中除病毒过滤控制是完整性测试。通常进行过滤器完整性测试以确保除病毒滤膜和整个单元的完整性。一些测试可以在使用前或使用后进行，而另一些测试可能是破坏性的（例如金颗粒），因此在使用后进行。完整性测试通常由过滤器制造商和用户执行。除病毒过滤器供应商通常会提供数据，以支持完整性测试与设备的病毒截留相关。然而，一些完整性测试仅提供针对严重缺陷的指示。
典型的除病毒过滤器完整性测试包括：
这些测试中的每一种都已在文献中进行了详细描述（PDA 2008）。与空气和水相比，使用氮气和酒精对气-液完整性测试的影响在 PDA TR41 中没有详细讨论。使用 30% 异丙醇会改变氮气的溶解度和扩散性，并导致扩散气体流量减少约 8%，这不会显著影响检测缺陷的能力。
过滤器供应商已经描述了二元气体过滤器完整性测试的使用。这些测试使用具有湿孔的过滤器以及快速和慢速扩散气体的混合物。任何缺陷都可以通过缓慢扩散气体的高流量（如下游的高浓度指示）来指示。这些测试已被过滤器制造商成功使用，但过滤器用户不太常用。
确定除病毒过滤的稳健性和现有的知识差距
如前所述，广泛接受的、通过除病毒过滤去除病毒的机制是基于尺寸的筛分，它相对不受病毒种类的物理化学特性的影响。数十年的除病毒过滤器规模缩小科学研究支持在不同的典型和最坏情况下的工艺条件下稳健、有效地去除病毒。除病毒过滤器研究中通常评估的参数包括进样压力、压差、产品加载、液流暂停或溶液条件（例如 pH 值、离子强度、蛋白质浓度等）。以下部分将就现有的已发表过滤研究进行了简要总结。
大病毒的有效清除
使用小截留病毒过滤器，也称为细小病毒过滤器，被认为是行业标准，作为专用的病毒清除单元操作。通过大 (35-50 nm) 和小 (~20 nm) 病毒截留过滤器去除大病毒，如鼠逆转录病毒 (80-110 nm)，已被证明是高度稳健且有效的。然而，对于小病毒截留过滤，孔径分布可能对截留直径为 20-30nm 的细小病毒构成挑战。对 1990 年至 2015 年提交的单克隆抗体 (mAb) 监管稳健的除病毒数据进行的 FDA分析表明，在所有 112 条大病毒截留过滤器记录以及471 条小病毒截留相关记录的 469 条中，大病毒稳健且完全清除（图 1）。如图 1 所示，报告的两个小病毒截留过滤器的非完全 X-MuLV 清除值的案例被确定为与研究相关。此外，文献中报道的逆转录病毒突破小孔病毒过滤器的实例也非常罕见，没有明确解释突破是否是过滤相关或研究相关。这突出表明，在除病毒过滤研究期间，应注意避免污染预计几乎不含病毒的滤液样品。最近的多公司数据审查表明，细小病毒截留过滤器可有效（即 >4 log10）或低于检测限地去除逆转录病毒以外的病毒范围，强化了小病毒过滤器提供强大的逆转录病毒清除能力的共识。
这些研究为使用小病毒（如细小病毒）进行除病毒过滤验证研究提供了强有力的理由。然后，细小病毒数据可能代表最坏的情况，以在监管文件提交中为较大的病毒（例如逆转录病毒）建立截留声明。
压力影响
被认为是除病毒过滤最坏情况的操作条件是那些通过非灾难性故障导致过滤器破裂的操作条件，这样过滤器完整性测试仍显示过滤器是完整的。非灾难性故障的假定故障机制是颗粒扩散，其中假设病毒在扩散造成流动中断期间迁移通过膜结构。被认为是最坏情况的操作条件（例如增加颗粒扩散）包括低跨膜压力、压力转换、低通量或压力/流量暂停。“使用荧光标记的 phi X-174 噬菌体和聚苯乙烯纳米球观察了流动中断期间膜内的病毒运动（例如颗粒扩散）结构。”一般而言，上一代除病毒过滤器在较低压力或流动暂停时病毒截留率下降，MMV 的对数减少值 (LRV) 取决于产品和进料溶液条件。在新一代除病毒过滤器中，尽管压力变化和流动暂停时间延长，但清除似乎很稳健。高压限制通常根据过滤器制造商或系统能力提供的结构完整性限制来设置。在过滤器限制内的高压差操作并不会通过非灾难性机制导致过滤器突破，因此，单是跨膜的高压差不太可能对病毒截留造成风险。
负载条件
另一个已知可能影响除病毒过滤器性能的参数是物料加载到过滤器上的条件。大量研究已经检查了过滤器在治疗性蛋白质纯化中典型的负载条件（如产品类型、产品浓度、pH、电导率和温度）范围内的性能。无论测试的负载条件如何，通过小病毒过滤器去除大病毒（例如，逆转录病毒、伪狂犬病病毒、呼肠孤病毒 3）是稳健的。这与尺寸排阻机制一致，并得到了跨越 20 年的 2000 多项验证研究的清除结果以及血浆行业的经验的证实。当使用小病毒过滤器清除细小病毒时，据报道有病毒突破。由于低操作压力和某些溶液条件的结合，可能会出现明显的病毒突破和较低的 LRV。然而，在推荐的操作压力下，病毒突破和单个进样液流条件之间没有明显的相关性。这表明在定义的稳健范围内操作以确保有效去除细小病毒的重要性。在许多情况下，进样液流条件会通过调节产品、病毒和滤膜的相互作用来影响通量或导致过滤器污染。因此，可以优化加载条件以提高过滤器通量和体积吞吐量。
支持过滤器性能的数据库研究
除了前面讨论的针对特定过滤器参数的研究外，行业团体、合同检测实验室和监管机构还进行了数据库研究，目的是获得真实生产过程中除病毒过滤器稳健性的跨行业观点。这些研究建立了稳健的病毒清除能力(至少4 log LRV)，尽管改变了压力(流动暂停)、进样液流溶液条件、病毒原液质量或过滤器类型。研究还表明，与第一代小病毒截留过滤器相比，新一代小病毒截留过滤器可能可提供略高的中位清除值(结合所有代际数据，5.0 vs 5.67 LRV)以及更低的可变性(图2)。几家公司报告了除病毒过滤器在各种工艺参数组合中的性能，这些工艺参数来自内部商业化工艺和除病毒研究。这些数据集提供了强有力的证据，证明在不同的工艺和产品类型组合中，各种商业化除病毒过滤器可以有效地去除细小病毒和逆转录病毒。表2-4总结了这些行业数据库研究的主要发现。
进行除病毒过滤器清除研究的注意事项：为了了解纯化过程去除病毒污染物的能力，除病毒过滤器清除验证应在配备了病毒学工作的实验室中进行，实验室应按照良好实验室规范的原则，在生产工艺的合格规模缩小模型上进行。除病毒过滤规模缩小模型的考虑因素包括过滤器负载/进样材料、病毒加标策略、预过滤器的使用以及工艺参数的潜在影响。规模缩小模型应该尽可能地代表商业化生产工艺 (EMEA 1996, ICH 1998)。这通过使用代表生产或最坏情况的进样材料和工艺参数进行小规模研究来实现。小规模模型通常可以通过演示在大规模操作下的工艺性能，包括产量、压力(在恒流操作期间)或流量(在恒压操作期间)，来进行针对使用的质量确认。因此，规模缩小质量确定实验通常仅限于验证性测试。
预过滤器
除病毒过滤器容易产生污染，因此经常需要使用预过滤器来实现所需的除病毒过滤器吞吐量。这些预过滤器对于规模缩小设备的选择也有限(供应商列表参见表1)。这对除病毒研究提出了挑战，因为当与除病毒过滤器一起使用时，一些预过滤器可能对去除病毒有很大贡献。为避免这一问题，预过滤可以独立进行，所得到的预过滤料液可以加入病毒并施加于除病毒过滤器。在许多情况下，将预过滤器与除病毒过滤器串联运行对于实现最佳吞吐量以及避免过滤器污染物的再次引入是必要的。因此，将两者分开可能导致较低的生产吞吐量和较高的成本。研究已经开发了另一种病毒加标方法，在内联预过滤器后使用高精度泵系统引入加标病毒，以在不影响病毒滴度的情况下实现预过滤器的全部效益。
进样物料（负载物料和病毒原液）
从产品质量属性和溶液条件来看，进样料液应该是生产过程中料液的代表。如果进样物料的性质受到冻融的影响，最好是在生产规模运行后不久获得进样物料，并在不冻结的情况下使用，或在小规模条件下，从前一个单元操作制备新鲜的物料，也或者可以过滤解冻的物料，以去除来自冻融过程的任何潜在堵塞性聚体或颗粒，其可能导致在验证研究中无法达到预期的体积吞吐量。
在除病毒研究中，病毒加标中存在的杂质会显著影响产品质量或体积吞吐量。因此，在保持产品过滤能力的同时，需要使用高纯度和高滴度的病毒原液来评估病毒去除效果。高病毒滴度有助于减少所需的加标病毒体积，同时允许测量完全的病毒清除能力。
病毒加标策略
正如ICH Q5A中所讨论的，为了描述单元操作清除和/或灭活病毒的能力，模式病毒应该提供有关单元操作性能的有用信息。在ICH Q5A中提出的病毒中，细小病毒MMV代表了小病毒截留过滤器验证研究中最差情况的病毒加标。因此，它经常被用作规模缩小除病毒过滤研究的相关模式病毒，此外，也包括其它细小病毒，如PPV，其可培养到高滴度。研究已经证明犬细小病毒(CPV)可以通过小病毒截留过滤器，并可被解释为最差情况模型。然而，应考虑到CPV与生产过程的相关性，因为与MMV不同，对于生物生产，CPV并不是真实世界中的污染物。
当设计用于除病毒过滤研究的病毒加标策略时，应该考虑几个因素 - 包括病毒滴度或病毒加标物料的纯度。研究表明，一些除病毒过滤器截留小病毒的能力有限。在这些情况下，过高的病毒加标值(例如每平方米1014病毒颗粒)不能代表典型的生产条件，可能导致LRV降低，应避免。新一代过滤器可能对更高的加标值更稳健。高纯度和低聚集的病毒库是所需的，以减少由于病毒加标引起的过滤物污染的风险。
感染性测定，例如组织培养感染剂量中值 (TCID50) 或噬斑测定是量化病毒清除 LRV 的首选测定方法。大容量检测是提高检测灵敏度和可要求 LRV 的常用方法。目前很少使用 qPCR 测定法，因为它可以检测残留的游离病毒核酸，这些核酸可能是也可能不是活性病毒颗粒。检测可以通过除病毒过滤器的游离核酸会导致人为降低 LRV，除非缓冲液的 pH 值可能导致灭活。
关键的挑战/差距/缓解措施
尽管病毒截留过滤器在截留大病毒(如逆转录病毒)和小病毒(如细小病毒)方面总体上具有稳健性和有效性，但对小病毒的截留可能变化很大，而且并不总是有效。虽然新一代小病毒截留过滤器的可变性似乎较小(图2)，但仍存在偶尔有效清除值较低的问题。为了解决这些问题，除病毒验证研究通常是在具有挑战性或最坏情况下进行的。科学研究似乎表明，在每次规模缩小除病毒验证运行期间，都应包括目标操作压力、低压、流动暂停和缓冲液条件。暂停通常发生在加载阶段和冲洗阶段之间，与低压运行不同，因为液体仅在低压阶段流过过滤器。已经尝试过完美匹配除病毒过滤过程中的压力上升和下降动态，但是不可能进行全面的实验，涵盖在常规生产过程中可能发生的压力条件和暂停的所有范围和组合。高压通常不被认为是最坏的情况，因为限制是由过滤器结构的稳健性决定的。
存在多种方法来设置除病毒过滤步骤的终点限制。据报道，对于一些早期型号的过滤器，由于孔堵塞和每个过滤器区域的总病毒负载量导致的通量衰减会降低病毒截留。类似地，据报道，每个过滤器区域的蛋白质质量或每个过滤器的蛋白质溶液体积可能是最坏的情况。例如，操作低载浓度将提供最高的体积（L/m2）吞吐量和病毒载量，但最低的质量（g/m2）吞吐量。相反，考虑到在较高负载浓度下过滤器污染增加的趋势，特别是在使用规模缩小的过滤膜时，使用高负载浓度操作将提供最低的L/m2吞吐量和病毒载量，但最高的g/m2吞吐量。虽然可能发生污染以及如何设置终点限制的方式有很多，但最好以每平方米过滤面积的升数来描述过程中控制。
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原文：S.Johnson, S.Chen, G.Bolton, et al., Viral Filtration: A Review ofCurrent and Future Practices in
Bioprocessing. Biotechnology & Bioengineering, 2022, https://doi.org/10.1002/bit.28017.
