现有技术的新兴应用

屏障过滤

病毒污染的一种潜在来源是细胞培养中使用的原材料，例如培养基或营养物以及葡萄糖补液。生物来源的原材料含有病毒污染物的风险最高。然而，某些高或低 pH 值的补液不允许病毒传播，因此它们可能不需要降低病毒风险。为了避免细胞培养成分的潜在病毒污染，可以实施除病毒过滤、高温短时间 (HTST) 处理、酸处理、去污剂处理、紫外线灭活和伽马辐照。理论上，这些方法可以由培养基供应商实施，但运输和接收大量液体培养基的可操作性使得制造商在现场进行更加现实。除病毒过滤可适用于各种生产过程，包括实施可抛弃型、一次性生产的设施，包括细胞和基因治疗等新产品。除病毒过滤的优点是不会向培养基中添加新成分，并且破坏或沉淀生长因子或营养物质的风险最小。最近推出了专门用于过滤细胞培养基的过滤器。其它通常用于下游工艺的过滤器由各供应商销售，用于过滤细胞培养基，如下表 5 所示。

执行这些原材料的除病毒过滤存在几个挑战。获得病毒去除的完全保证是一项挑战，因为这需要在生产反应器之前，对用于细胞系开发、存储和所有细胞培养规模放大步骤的所有培养基进行除病毒过滤。使用除病毒过滤器可能会增加资金成本、占地面积要求和操作复杂性。与传统的除病毒过滤方法一样，必须考虑过滤器的使用前冲洗和完整性测试。应通过单独热处理来避免某些培养基成分（例如剪切保护剂、消泡剂等）造成的堵塞。

将除病毒过滤器用作屏障方法的另一个潜在挑战是培养基组分（即剪切保护剂，如 Pluronic F-68、嵌段共聚物、消泡剂、非离子表面活性剂、IgF、胰岛素、金属离子、葡萄糖、氨基酸、维生素、脂质、脂肪酸、微量元素和抗生素）和除病毒过滤器之间的潜在相互作用。必须确保任何过滤器溶出物/析出物不会影响细胞培养工艺或产品质量，或者关键培养基成分不会被过滤器截留。培养基除病毒过滤的影响可能需要在规模缩小研究中针对细胞培养生物反应器 vs. 对照组进行评估。

现有文献没有描述证明这些过滤器的除病毒能力的方法，因此，供应商目前主要研究过滤器病毒截留性能的证明，以支持他们的产品。一些培养基过滤器已被证明可以截留病毒和细菌。

研究模型

正如本文前面所讨论的，除病毒过滤工艺的验证和开发需要规模缩小模型研究。然而，这些研究可能是费力、昂贵且耗时的。不充分的研究设计可能会导致过滤器尺寸不合适。在极端情况下，在工艺规模中，可能由于过滤失败或污染，会触发再处理需求。改进模型设计的新策略的出现将减少针对小规模代表性建模的一些障碍。一种这样的策略是针对除病毒过滤，使用用于填料筛选的高通量工艺开发 (HTPD)。滤板技术与自动化液体和板处理系统相结合，可在过滤工艺开发中实现高通量分析。可以快速筛选可能影响关键工艺参数（例如通量衰减）的工艺条件（例如负载条件）。Tang 等人的初步工作为HTPD 过滤板筛选提供了框架。这些工具可以在工艺开发的早期快速筛选出故障模式条件。

其它有助于改进过滤器工艺开发的新技术包括粒子追踪技术。如前所述，这些粒子跟踪技术使用金或荧光粒子，但只能跟踪聚合粒子的运动。这些技术可用于模拟流量和流量中断的影响。一个缺点是这些研究往往具有较高的材料成本。单粒子跟踪技术的出现，例如 Wu 等人 2020 提出的纳米粒子，已用于 PVDF 膜过滤器。在这些技术中，纳米粒子被连续成像，例如使用光学显微镜，并实施跟踪算法来定位粒子位置，从而生成理论上可以适应除病毒过滤流动研究的轨迹。

新兴生产模式

在设计用于除病毒过滤的工艺和规模缩小病毒清除研究时，需要特别考虑较新的生产技术（例如连续生产、基因治疗载体）。

对于非常小的基因治疗载体，如 AAV，可以想象在下游生产中使用大病毒截留过滤器作为较大污染性病毒的风险缓解屏障。预计AAV 会通过这些过滤器，而 RVLP 等较大的病毒则会被困住。虽然有一些研究评估了除病毒过滤器在该领域的使用，但这一概念在该治疗类别中的采用需逐案考虑。

连续生产的本质是从一个单元操作到下一个单元的无缝过渡，这对除病毒过滤单元的操作提出了挑战。除了下面讨论的独特加标策略外，集成式单元操作还必须考虑在端到端工艺单元操作连接中可能出现的更长的处理时间、连续但可能较低的流速以及更高水平的杂质和产品滴度的影响。避免堵塞和过滤器过载问题的一种潜在策略，是在过滤器达到经过验证的总体积吞吐量之前，实施并行切入/切出过滤方案。除了传统的过滤压力监测之外，累积流量的监测将允许在达到既定过滤器处理量时，控制从第一个过滤器切换到第二个过滤器。已有多个小组已经针对此类研究进行了概念验证，并显示出与传统批次式除病毒过滤相当的清除值。

用于连续除病毒过滤的“过滤器链”的概念也被认为是一种潜在的策略，可以在延长的工艺时间内提高杂质清除率并提高除病毒过滤器的整体寿命。多个过滤器串联放置，没有管路或压力中断，以通过深层过滤进行澄清，TFF 进行产品浓缩，带电膜过滤器作为进一步去除杂质的低压选项，最后除病毒过滤用于初级病毒清除。该过滤器链可以减少设施占地面积，以及可能实现更快的工艺时间，但需要讨论如何验证这些链中的正交病毒清除步骤。

如上所述，与批次除病毒过滤相比，集成式连续除病毒过滤的规模缩小模型的开发可能会带来一些挑战。这些挑战包括 1) 在恒定流量下进行除病毒过滤，2) 增加体积通量和延长工艺时间，以及 3) 可能由于蛋白质和缓冲液浓度的显著波动而产生动态产品液流的可能性。虽然使用恒流可能不是一个困难的挑战，因为这种操作模式也可以在批次模式下发生，但可能需要对泵的行为进行适当的建模，以避免小规模的脉动。更大的挑战是如何针对更高的处理体积和工艺时间执行病毒加标。病毒加标的传统方法可能令人“望而却步”，因为增加的吞吐量需要更高的病毒加标浓度或更大体积的病毒。这也可能导致过滤器病毒过载，这在之前被讨论为某些除病毒过滤器的一个已知问题。相反，可以实施低滴度病毒加标以避免超载；然而，由于检测灵敏度和线性范围降低，这可能会降低可实现的清除率值。病毒加标的另一个挑战是在延长的工艺时间内保持病毒的传染性。传统加标可能会在过滤研究过程中遭受感染性的重大损失。已经有研究提出了替代性加标策略。提议的加标策略包括在过滤研究的开始和结束时在小体积中加标高病毒载量，在大部分工艺体积中没有病毒或低滴度病毒加标。这种方法能够达到相似的总病毒加载和清除值，最高可达 2300 L/m2，同时通过仅在过滤研究的开始和结束时加标病毒，来避免潜在的病毒超载和感染性丧失。

避免感染性丧失的另一种方法是在整个过滤研究中每天增加一次新的病毒加标。在这种方法中，可以在实验期间每 24 小时对过滤器施加一次新的加标。为避免过滤器病毒过载，应在研究前确定总病毒加标值，并根据每天的合理负载滴度进行计算。应注意无缝整合新鲜负载，避免引入可能对过滤研究产生负面影响的气泡或压力波动。这种方法能够证明 LRV >6 log₁₀，最多 4 天和 2900 L/m²。

最后一种加标方法将病毒原液与进料溶液混合至所需的病毒滴度，然后通过 0.1 µm 除菌过滤器对最终进料溶液进行预过滤，以模拟预过滤器用于聚体的做法。然后以0.3 L/m²/hr的恒定流速将进样以连续速率泵送通过除病毒过滤器长达 72 小时。每天两次和过夜采集上样样品，而不向进样溶液中添加新的加标。考虑到病毒滴度的潜在损失，该研究计算的 LRV 等于每日负载滴度的 log₁₀ 减去每日池样品滴度的 log₁₀。

这些研究为加标策略提供了框架，并提供了强有力的支持证据，证明存在连续除病毒过滤的有效模型。尽管这些规模缩小模型中延长的工艺时间似乎不会影响病毒降低，但需要考虑过滤器析出物等其它方面的影响。

新兴技术

除病毒过滤器，由于其使用的性质，最初设计为一次性系统，可以很容易地适应新近流行的模块化、一次性设施系统。然而，当前除病毒过滤技术的一个普遍接受的缺点是成本较高。

在这里，我们将讨论潜在的技术，无论是商业化前的还是成熟的，它们最终有可能被“改造”为传统除病毒过滤器的正交选项。

如前所述，深层过滤器已被用作除病毒过滤的预过滤器。然而，由于硅藻土源性深层过滤器的批次间差异，因此很少声称它们可以清除病毒。合成源性的深层过滤介质的最新进展显示出了更高的工艺性能和批次间的一致性。由于这些改进，较新的深层过滤器被认为是用于除病毒过滤的传统纳米过滤器的正交病毒清除组件。一般来说，深度过滤器已经适用于高密度连续培养系统和更高的上样滴度。较新的合成深层过滤器还显示出具有更高的宿主细胞源性杂质清除水平。因此，这些更新的一次性深层过滤器为病毒清除提供了一种正交选择，特别是在具有更长工艺时间和更高杂质以及整体滴度分布的连续工艺中。这也可以为除病毒过滤器提供更长的使用寿命，并扩展其经济性过滤更多产品的能力，这是连续液流的一个好处。然而，需要研究来证实这些较新的深层过滤技术的除病毒能力。此外，供应商正在构建数据库，以更稳健地建立除病毒能力。

除了传统过滤技术之外，还有许多处于商业化前阶段的、令人兴奋的技术可以开发并适应工艺规模应用。这些包括使用电纺纳米纤维、结晶纤维素纳米纤维、陶瓷毛细管膜或等孔自组装嵌段共聚物薄膜。吸附混合过滤器的出现可以为生物技术产品提供两步纯化。然而，用于除病毒验证目的的正交性问题可能会随着它们的使用而出现。

另一种潜在的、节省成本的新兴技术是源自纤维素的“滤纸”，它可以在使用点应用，并且在过滤器尺寸和孔径分布方面都可以轻松扩展。多个小组已经证明了这些纳米纤维素滤纸去除噬菌体、XMuLV 和 MMV 的能力，以及在典型的生物工艺流体中使用的可行性，例如细胞培养基。

虽然在商业使用之前还需要做更多的工作，但其中许多技术为传统的除病毒过滤提供了潜在的正交且经济的选择。

总结

除病毒过滤通常用于精心设计的重组治疗性蛋白质纯化工艺中，并且是在生物技术产品生产过程中将外源和内源性病毒颗粒风险降至最低的整体策略中强大而有效的组成部分。

关键要点包括：

• 基于数十年的数据达成共识，即细小病毒过滤器可在各种工艺和产品类型中稳健去除小型和大型病毒，这为以小病毒作为最坏情况进行除病毒过滤验证研究，以针对监管提交中更大的病毒，建立截留声明。
• 根据最近的数据，病毒截留的最坏情况包括低跨膜压力、压力转换、压力或流动暂停以及低通量。
  对于除病毒过滤的规模缩小模型，主要考虑因素包括：
• 应包括过滤上样/进料、病毒加标策略、预过滤器的使用以及工艺参数的潜在影响，例如目标操作压力、低压、流动暂停和缓冲液条件。
• 除病毒验证研究应在具有挑战性或最坏情况的条件下进行，使用代表性进样物料。
• 需要高纯度和高滴度的病毒储液来评估除病毒情况，同时保持产品过滤能力。
• 除病毒过滤器通常需要预过滤器来实现所需的除病毒过滤器吞吐量。当与除病毒过滤器串联使用时，预过滤器可能会去除病毒，因此需要新的加标策略。
  需要考虑的新兴病毒过滤技术包括：
• 用于各种生产工艺的培养基除病毒过滤，包括实施可抛弃型、一次性生产或细胞和基因治疗等新兴产品的工厂。
• 新的除病毒过滤器开发策略，包括 HTPD 和滤板技术，以及与自动化液体和板处理系统的结合。粒子跟踪技术可用于模拟流动和流动中断的影响。
• 连续生产中的除病毒过滤需要新的加标模型，例如切入和切出过滤、过滤器链以及每日加标。
• 深层过滤器、电纺纳米纤维、结晶纤维素纳米纤维、陶瓷毛细管膜、纤维素滤纸或等孔自组装嵌段共聚物薄膜是潜在的新型除病毒过滤方式，需要进一步开发，以用于商业应用。

随着技术和全行业工艺知识的不断改进，将继续依靠除病毒过滤来提供强大而有效的病毒清除。