• “硬件”（hardware）和资产（例如，分析仪器、生物反应器和设施）

• “软件”（software）和知识（例如，过程控制、质量源于设计 (QbD) 和过程分析技术 (PAT)）

• “湿件”（wetware）技术（例如，表达系统、细胞系开发、培养基和新兴模式，如细胞和基因疗法）

20年中发展最大的20个领域

硬件

(1) 工厂考量：宴会厅和模块化生产概念、设备安装、技术转移、仪器质量确认和工艺验证

(2) 封闭的模块化细胞培养隔离系统和无菌工艺的相关进展

(3) 单细胞克隆和筛选系统

(4) 生物反应器系统，具有多种操作模式（补料分批/连续、悬浮/贴壁）、混合技术、高密度和延长的高活性培养能力、（近线/在线）采样和监测技术以及过程控制

(5) 跨规模和产品运行的灌流细胞培养系统软件

(6) 集成到细胞培养系统的技术选项

(7) 质量源于设计 (QbD)、实验统计设计 (DoE)、高通量筛选和规模缩小建模的能力

(8) 自动化和过程分析技术 (PAT) 通过测量关键过程参数 (CPP) 来改进关键质量属性 (CQA) 的设计、分析和控制

湿件

(9) 病原体安全和污染控制

(10) 培养基成分：无血清和化学限定配方以及添加物与哺乳动物宿主细胞和细胞驯化方法相结合

(11) 培养基制备：培养基配料、培养基粉水合、培养基筒和防止结块的工具

(12) 细胞建库和种子复苏稳健性

(13) 哺乳动物细胞系开发：提高转染效率和代谢工程；开发表达宿主、以提高产品表达水平并具有一致的产品质量属性 (PQA)

(14) 用于基因治疗的细胞治疗培养系统（自体和异体）以及病毒生产系统

(15) 基因工程游戏规则改变者（靶向表达和基因组编辑）(16) 细菌蛋白表达：大肠杆菌和荧光假单胞菌表达系统、包涵体溶解、产物分泌和整体回收率的改进

(17) 替代表达系统：酵母细胞的生长应用、具有杆状病毒表达载体系统 (BEVS) 的昆虫细胞、植物细胞培养系统、无细胞表达和全生物体生产（例如，在转基因-动物奶和整株植物的分泌物）

整体进步

(18) 在工艺开发和调查研究中具有跨规模（上、下）的可放大性

(19) 上游产品质量控制和杂质检测的改进，例如宿主细胞蛋白 (HCP)

(20) 基线：降低成本、提高效率、缩短时间、产品质量稳定

尽管“wetware”（湿件）这个术语自 1950 年代以来已在小众科学论文中使用，但科幻作家在诸多“赛博朋克”小说中普及了这个的概念，比如1985 年出版的Bruce Sterling 的 Schismatrix。当应用于生物技术时，它的定义类似于“湿化学”（wet chemistry）对一些实验室的描述。活细胞、组织和生物体本质上是“湿的”，因为它们是高度基于水的实体，生物过程本身发生在流体环境中。

哺乳动物细胞系的发展：被广泛“吹捧”的一个成就是表达滴度的提高，特别是单克隆抗体(mAb)，行业在21世纪之交取得的成就主要来自工艺优化工作以及培养密度的提升。然而，从那时起，细胞系工程就成为了该行业进一步提高多种蛋白质产量的手段。伴随着已被证实的代谢工程方法，这项工作已将20年前中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞培养培养可获得1 g/L的目的蛋白滴度提高到了现在的两位数水平。由于先进的分析技术使风险管理和QbD得以实现，这一“壮举”已经在良好生产规范(GMP) 指南要求的产品质量属性监测、控制和维持的同时完成。

特别是在过去的几年里，很多报道记录了这些进步，并强调了帮助实现这些进步的工具。其中最主要的是来自Molecular Devices的ClonePix菌落采集器，Berkeley Lights的Beacon系统，以及来自Sartorius公司的Ambr微型生物反应器和Octet生物分子层干涉测量系统。随着临床速度成为生物制药公司的普遍目标，为它们服务的合同开发和制造组织 (CDMO) 也报告了工作流程的改进，将细胞株开发时间从几个月缩短到几周。瞬时转染提供了另一种途径，使产品快速进入测试，而传统的稳定细胞系工程和开发工作则继续并行进行，以实现最终的大规模生产。

基因工程：毫无疑问，细胞系工程正处于一场革命之中。基因组编辑技术正在改变游戏规则。早在2006年，Morphotek作者就在文章中描述了一种“全基因组进化”方法。不久之后，我们开始在会议上听到关于锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活物样效应器核酸酶 (TALEN) 技术在细胞系工程中的潜力的讨论。但随着CRISPR和CRISPR-相关蛋白Cas9的出现，事情真正升温了，它们共同提供了一个强大的系统，可以原位改变细胞染色体序列。

与之前的ZFN和TALEN不同，CRISPR-Cas9系统使用起来相对简单，而且价格低廉- 尽管其相关知识产权的法律复杂性尚未解决。当这些不可避免的困难得到解决时，我们预计CRISPR的应用将在整个行业中得到扩展。与此同时，表达盒工程和基因敲除技术继续为靶向和控制表达、甚至一些翻译后修饰 (PTM) 提供改进的序列，如N-链糖基化。

单细胞克隆和筛选：细胞克隆和筛选技术近年来取得了重大进展。传统上，在这类工作中，含有血清的培养基被用于促进细胞贴壁，单细胞被克隆，并经过多轮筛选。接下来必须努力使细胞脱离对血清的需求，并使它们适应悬浮培养，这将大大延长细胞开发的时间线。其它缺点包括血清的潜在安全风险以及缺乏可靠的可追溯性，以确保单细胞克隆作为生产细胞系的基础。此外，也要考虑到，当脱离含血清培养基并适应无血清条件时，那些在生产力、生长和表达蛋白的质量方面排名最好的克隆往往不会表现出同样的性能和稳定性。

在过去的几十年里，许多细胞特异性生产力和单位体积产品滴度的显著提高(同时保持稳定且可再现的产品质量) 的成就可以归因于克隆筛选和选择系统的效率和通量的提高。其它贡献包括目标(而不是随机) 基因组整合和宿主细胞系工程。尽管有些解决方案，比如价值数百万美元的Berkeley Lights系统，对于小型初创实验室来说可能遥不可及，但许多解决方案可以通过合同服务商和合作伙伴关系得到。

细胞库：无论细胞类型是什么，一旦克隆在无菌条件下被筛选出来，通过对生产力、生存能力、生长和产品质量属性等关键标准的筛选，该单细胞将被培养成细胞库。最初生产一个主细胞库(MCB)，从其中解冻冻存管，并进一步扩增生成多个工作细胞库 (WCB)，用于长期存储，其可用于未来的每次生产活动。近年来取得的重大进展改善了确保和记录单细胞来源克隆性的技术，使其与当前药品生产质量管理规范(CGMP) 的长期一致性得以保持。随着技术的进步，监管机构的期望也逐渐强调了克隆性。

其它方面的改进使WCB在解冻和放行使用时能够通过广泛的表征和测试，达到越来越高的标准：例如，纯度、一致性、遗传稳定性以及潜在病原体或外源性物质的存在。在使用之前，细胞被保存在低温保存介质中，通常是在温度设置为-70℃以下的冰柜或在气相液氮罐中。为了降低可能损害质量/性能的风险，细胞库存储在多个受控位置。当需要时，冻存管从储存设备中取出并在受控和记录的条件下运输，直到其到达使用地点。ICH指南 (Q5 a, b, d) 为确保在药品整个生命周期中生产的产品批次的一致性和质量提供了帮助。

培养基和添加物：哺乳动物细胞是生产蛋白质疗法的普遍宿主，其中类人PTM (如糖基化) 和复杂的三维结构对有效功能、增加稳定性和降低免疫原性至关重要。CHO细胞是最常用的宿主，特别是在产生mAb的工艺中。20年前，动物血清由于其促进贴壁的作用，在克隆和促进生长及生产力的生产培养基中仍被广泛使用。然而，出于安全考虑 - 例如与病毒和传染性海绵状脑病 (TSE) 有关的问题 - 以及血清定义不清的性质和固有的可变性，使行业开始转向无血清和化学限定的培养基配方。这在很大程度上是由细胞系驯化方法以及不再依赖细胞贴壁的创新克隆策略实现的。

通常在工艺开发过程中，为了优化目的，需要单独添加特定的培养基成分，因为工艺工程师需要根据生产细胞系以及工艺定制最终的培养基配方。由于时间线不断收紧，培养基配料方法通常从早期开发直接推进到商业生产，仅进行最小的改变。精简培养基分批操作可以简化补料分批培养的操作，甚至可以简化依赖连续大规模培养基批次操作的灌流工艺。无论是使用专有/内部培养基配方还是现成的商业选择，上游团队会发现，简化培养基制备过程的投资可以带来显著的节约和运营优势。在干培养基制造、包装和培养罐补液方面的更新技术- 通过生物制造商和培养基/服务提供商之间的紧密合作日益得到发展- 使该行业比以往任何时候都更接近其封闭式、连续生产的目标。

微生物表达：尽管目前哺乳动物细胞培养占主导地位- 特别是CHO细胞 - 微生物表达系统将继续在生物制药生产中发挥重要作用。从生物技术的早期开始，E.Coli就一直是激素和其它不需要糖基化的小蛋白质的首选生产方案。只要可行，细菌表达作为首选的原因有很多：高表达水平和低开发成本，以及基于许多可用的通用质粒载体以及宿主菌株的基因工程的简单性。

细菌生产不可行的时候，真核微生物，如酿酒酵母和毕赤酵母，可能是另一个可行的方案。2017年和2018年批准的胰岛素产品以及最近开发的一种乙肝疫苗就是这种情况。真菌除了能够对表达的蛋白质进行重要的PTM外，还提供了许多与细菌生产系统相同的优势。然而，其生产水平不如细菌高，因为重组产物的生产会给真菌细胞带来压力。相对简单且更好表征的蛋白质，如肽，细菌占据主导地位。

现在已经有了大量的细菌和真菌菌株，它们被设计成不同的形式来表达重组蛋白、多肽和质粒DNA - 有些甚至能够将具有生物活性的可溶性蛋白质分泌到细胞培养基中 (而不是作为包涵体，在这种情况中，目的蛋白质复性和进一步处理之前，必须先变性)。随着生物制药产品模式范围的扩大，微生物生物工艺将继续存在，并将与时俱进。

其它表达系统：尽管哺乳动物细胞培养约占所有生物制药生产的三分之二，微生物生产约占四分之一，但剩下的少数百分比既多样又创新。一些早期的研究“吹捧”转基因全生物来源的潜力(例如，从动物奶和植物组织)，尽管这种方法没有像它的先驱们预测的那样给行业带来革命，但最近的文章表明，一些公司已经发现了它的真正应用。如今，植物细胞培养方法可能比全生物转基因更有前途。

与此同时，利用杆状病毒表达载体系统(BEVS) 瞬时转染昆虫细胞已经在病毒载体和疫苗 (如用于人类乳头瘤病毒免疫的疫苗) 的生产中建立了根基。

最后，复杂蛋白质的无细胞合成 (CFS) 的想法 - 曾经被认为几乎是不可能的 - 正在成为一个越来越可行的替代方案。如果有什么东西能被证明是真正颠覆生物生产的，那么CFS在未来就可能可以实现。

产品质量：原料药的许多重要产品质量属性(CQA) 直接受到上游生物工艺条件的影响。所选择的细胞系、培养基/原料和培养工艺参数和条件都会影响CQA，并成为宿主细胞蛋白质 (HCP) 等杂质的潜在来源。在细胞系选择和开发过程中，通过综合筛选设计，能够越来越多地获得理想的产品质量属性。通过改进检测技术，减少了关键属性检测的样品体积需求。从克隆筛选、到工艺开发、再到商业化生产的培养基和工艺的一致性提高了满足原料药CQA的可预测性 - 基于在整个开发过程中使用相同的培养基以及使用可再现完整规模生产条件的小规模系统(例如，来自Sartorius的Ambr微型生物反应器系统)。即使是灌流系统，曾经对规模缩小研究提出了独特的挑战，现在也已成功缩小规模，从而提高了产品开发过程中的可预测性，以满足CQA和其它目标。

杂质可能来自培养环境 (例如，培养基成分的夹带) 或宿主细胞本身。与产品相关的杂质通常以不正确的形式形成(例如，截断或多聚化) 蛋白质，这可能影响生物活性、安全性或有效性。来自宿主细胞的杂质可能包括核酸、蛋白质和其它细胞成分。特别值得关注的是，HCP可能与蛋白质产物一起纯化，最终在患者中引发不良的免疫反应。因此，针对HCP设定了限值。

建立可靠的HCP检测和估计方法是重要的，这是近年来取得很大进展的另一个领域。经常使用几种互补的方法。例如，使用针对亲本细胞株和/或宿主株产生的抗体构建的酶联免疫吸附分析 (ELISA)。色谱、质谱和多维分离等技术可以帮助分析人员识别和量化HCP，以达到杂质表征和控制的目的。

底线

从上游到下游，从原料药到药物产品，从工艺开发到临床试验，生物制药行业的每一个团队都面临着来自公司管理层的相同任务：降低成本，提高效率，缩短时间，且不影响质量。这些目标不仅来自外部- 投资者希望他们的资金获得更多回报，监管机构要求安全和有效性，患者需要他们负担得起的治疗 - 而且还来自公司内部。这种趋势反映在本文所强调的进步中。在实现这些目标的过程中出现了问题，技术提供者帮助提供了解决方案，推动了上游生物工艺工作的向前发展。

过去的成就可以说明近期的发展趋势；然而，不可预见的“颠覆性”技术可以产生重大进步，改变未来的发展进程。我们在上面提到的每个类别中都看到了这样的例子。在硬件方面，一次性使用技术和相关辅助技术的影响超出了上游和下游单元操作本身，改变了清洁和验证操作、规模放大/缩小、工厂设施设计、技术转移和工艺经济性。在快速发展的软件领域，将QbD与PAT结合起来，由统计、风险和基于知识的方法所支持，加快了工艺开发时间线，推动了更高的产量，并提高了生产操作的效率，并增加了满足目标CQA的控制和保证。CRISPR和克隆系统技术等湿件技术改变了游戏规则，反过来帮助细胞系开发人员实现了长期寻求的目标，如定向集成和记录单细胞克隆。在最初备受瞩目的挫折之后，先进疗法(基于基因、细胞和组织的疗法) 产品已经因其治疗或治愈疾病的革命性潜力而得到业界和监管机构的认可。从许多公司目前的管线以及最近和即将发布的针对性指南可以明显看出，ATMP有能力满足此前未被满足的医疗需求。

尽管几乎不可能预测未来会开发或发明什么技术，但对于上游生物工艺的未来，有一件事是肯定的：该领域正处于转型时代，将继续吸引最聪明的人为社会造福。如果过去是序幕，那么未来很可能会带来更好、更快的工艺，为世界生产更多负担得起的生物药。我们期待通过在行业中发挥作用，促进突破性信息和知识的交流，开启激动人心的旅程。

原文：Y.Shimoni, Cheryl Scott, Hardware, Software, and Wetware: 20 Years of Advancements in Biopharmaceutical Production, Part 2. Bioprocess International, 2022.