危害社会的新疾病和病毒暴发的出现要求药品生物生产技术能够适应不断变化的情况和新的挑战。瞬时基因表达 (TGE) 等技术的通用性为这个问题提供了解决方案。TGE 通常用于实验室规模和临床前试验中目的蛋白质的批次生产、筛选分析方法以及为不断发展的基因治疗领域生产特定的生物药物，如腺相关病毒 (AAV)。与稳定基因表达 (SGE) 工艺相比，在宿主细胞中瞬时表达以游离形式存在的异源基因提供了某些优势。通过在宿主细胞中整合编码目标蛋白质的基因来产生稳定的细胞系是一个费时费力的过程，需要 3 到 12 个月，而使用 TGE 可以在数周内提供高滴度的目的生物制品。TGE 容易建立且可直接实施，从而降低的成本和时间要求，使 TGE 成为一项有价值的技术。更重要的是，TGE 提供了适应不同情况和市场需求所需的通用性，因为生产可以使用相同的细胞平台从一种产品切换到另一种产品，仅改变转染的质粒 DNA。

尽管已可实现大体积规模，并使用符合 GMP 的生物工艺，但 SGE 仍然是在成熟的生物工艺中大规模生产生物药的首选技术。然而，基于个体遗传和表观遗传生物标志物的个性化医疗的兴起，需要量身定制的药物和疗法，行业已将重点转移回 TGE。药物变体生产的适应性和通用性使 TGE 成为设计用于个性化治疗的、具有成本效益的生物工艺的良好候选者。除了按照 GMP 标准生产 TGE 所需的大量DNA 质粒的挑战外，阻碍 TGE 大规模开发的主要缺点之一是所谓的细胞密度效应 (CDE)。尽管对 CDE的定义存在细微差别和争议，但它可以被普遍接受为细胞生产力的降低，因为瞬时表达在增加的密度下进行。在进行杆状病毒感染的昆虫细胞中，以及在进行病毒感染的禽类和哺乳动物细胞中，也报告了这种效应。在生物工艺产量方面，生产力下降的相同观察归因于 CDE，作为一个术语，它包含许多不同的分子、代谢、生理和物理化学因素，这些因素通常相互交织，而对该现象的解释仍不完全清楚。本文旨在彻底分析报告的生物工艺与 CDE 的情况，讨论它对大规模实施 TGE 技术构成的担忧，并回顾克服 CDE 的成功案例，同时讨论控制它的主要因素，并分析未来的潜在解决方案。

更好地定义 CDE 的第一步，是确定进行 TGE 时，什么是动物细胞技术中的高细胞密度 (HCD) 。对于批次培养模式，据报道瞬时转染通常以~2 x 10⁶cells/mL的密度进行，因为细胞通常不会生长超过 5 – 6 x 10⁶ cells/mL。因此，在~5 x 10⁶ cells/mL 时观察到与 高细胞密度 状态相关的影响，因此这些被称为 高细胞密度。然而，培养基的进步允许批次培养高达 8–12 x 10⁶ cells/mL，且开始观察到在 ~10 x 10⁶ cells/mL 的细胞密度下与 高细胞密度 相关的影响。有研究甚至将 高细胞密度 一词总结为 ~1 x 10⁶ cells/mL 的细胞，甚至在没有具体说明所对比的实际细胞密度时声称为 高细胞密度。此外，在批次培养中可以达到的细胞密度取决于特定的动物细胞平台，这在哺乳动物、禽类和昆虫细胞之间有所不同。然而，在任何情况下，当瞬时表达超出对数生长期中期时，会观察到转染或感染批次模式细胞培养的细胞密度限制。同样，在补料分批和灌流模式下工作时，对数生长期达到更高的密度，延迟 CDE 的出现，在此框架中，术语 高细胞密度 转变为 ~50 x 10⁶cells/mL 和高达 ~200 x 10⁶ cells/mL。考虑到所有这些方面，准确定义 高细胞密度 是相当具有挑战性的，这使得对在关于 高细胞密度的不同研究报告中得出的结论进行比较变得复杂。因此，高细胞密度的定义应始终与细胞培养基、使用的细胞系和操作模式关联，理想情况下，应说明 高细胞密度 值所对比的实际细胞密度。

细胞和培养基工程领域的重大进展拓宽了利用各种动物细胞系开发生物工艺的可能性。尽管多样化增加，但 CDE 是一个常见的相关因素，它影响多个基于 TGE 的工艺，无论细胞来源和表达系统如何。文章的这一部分旨在总结和讨论主要动物生产平台的差异，以解决 高细胞密度 工艺性能的限制。

两种主要使用的昆虫细胞系是 High Five 和 Sf9 细胞，以及杆状病毒表达载体系统 (BEVS)。据报道，在 Sf900III 培养基中批次培养的 High Five 的最佳感染细胞密度约为 2 x 10⁶ cells/mL，MOI 为 2.5。当在Insect-XPRESS 培养基中培养时，补充半胱氨酸的补料分批在 2.5 x 10⁶cells/mL 时感染且 MOI 为 5 时，可提高产品滴度。假灌流策略允许实现High Five细胞卓有成效的感染工艺开发，其使用Insect-XPRESS 无血清培养基，密度为4 x 10⁶ cells/mL，MOI 为3。对于Sf9 细胞，当以Sf900-II 培养基进行批次培养时，以1 x 10⁶ cells/mL 的细胞密度被正确感染，MOI 为 0.6 或 30。以同样的趋势，Liu 等人发现在 DMEM 培养基中，批次培养的 Sf21 细胞的最佳感染细胞密度为 1 x 10⁶ cells/mL，MOI 为 5。Meghrous 等人还报告了 Sf9 在 Ex-Cell 420/405 中的良好感染率，MOI 为 5，密度为1×10⁶ cells/mL。新开发的昆虫细胞平台试剂盒（如ExpiSf9）在5×10⁶ cells/mL、MOI为1时具有最佳感染细胞密度。与批次培养相比，使用Sf900-II 培养基中的Sf9 细胞进行AAV补料分批生产并以 MOI 3进行感染，允许在 10 x 10⁶ cells/mL 的细胞密度下维持特异性病毒产量。此外，Sf9 细胞的工艺强化允许在密度高达 27 x 10⁶ cells/mL时延迟CDE。当在 Ex-Cell 401 培养基中以 27 x 10⁶ cells/mL 培养并以 MOI 1感染时，Sf9 细胞表现出与低细胞密度 (LCD) 批次培养相似的性能。

领先的动物细胞技术研究，CHO 细胞是报告的细胞密度最高的细胞平台之一，在灌流生物反应器中可达 >200 x 10⁶ cells/mL。尽管人们对基于一次性灌流的工艺越来越感兴趣，但补料分批仍然是多种 CHO 细胞系生物工艺开发的首选操作策略，通常达到 20 x 10⁶cells/mL。最近的补料分批强化策略使用高产稳定 CHO 细胞系的 高细胞密度 接种方法，使 高细胞密度 培养超过 30 x 10⁶ cells/mL。据报道，在批次培养中，CHO 细胞的细胞密度约为 8 x 10⁶ cells/mL。

HEK293细胞是 TGE 的首选平台。CDE 对在高细胞密度下实现有效瞬时表达的限制以及 CHO 细胞在 SGE 领域的优势，导致致力于在 HEK293 细胞中开发高细胞密度培养的研究较少。然而，Cervera 等人报道，在多种商业化培养基中批次培养的 HEK293SF-3F6 细胞可达到3 - 4.5 x 10⁶ cells/mL的细胞密度峰值，在补充脂质混合物的FreeStyle293 培养基中可达到 5.4 x 10⁶ cells/mL的峰值。同样，在 4 种商业化培养基中批次培养的、稳定表达E2-CD154蛋白的HEK239克隆，以及生长于HyCell TransFX-H 培养基中的野生型 HEK293 和 Bax-Bak KO HEK293 细胞系，可达到 3.5 x 10⁶和 5 x 10⁶ cells/mL 的相似细胞密度。稳定表达PYC酶和IFNα2b的HEK293-E6在FreeStyle F17培养基中以补料分批操作时，细胞密度可达到11 x 10⁶ cells/mL。此外，基于在线监测的补料分批策略允许在 SFMTransFx-293 培养基中培养的 HEK293-3F6 细胞达到19 x 10⁶ cells/mL的细胞密度，尽管补充了 5% FBS。使用灌流方法，在BalanCD HEK293培养基中培养稳定表达EPO的HEK293F细胞时，达到了报道的、该细胞系的最高细胞密度，80 x 10⁶ cells/mL。

鉴于禽类细胞具有大规模生产疫苗的能力，人们对它们的兴趣已经开始在上升，旨在取代依赖鸡胚的生产过程。AGE.CR.pIX 在 CD-U2 培养基中的批次培养可达到 14 x 10⁶ cells/mL，在适应谷氨酰胺饥饿条件后，可增加到 17 x 10⁶ cells /mL，显示出与 CHO 或 HEK 细胞相比更大的生长能力。相比之下，新型禽细胞系，如 DuckCelt-T17，在 Optipro SFM 中培养仅达到 5 x 10⁶ cells/mL。工艺强化可使AGE1.CR.pIX 细胞在 CD-U3 培养基中达到 50 x 10⁶ cells /mL的高细胞密度培养。

尽管大规模瞬时转染对质粒 DNA 的需求很大，并且需要生产大量符合 GMP 的质粒，但基于 DNA 复合的瞬时表达系统是 TGE 最广泛使用的方法。磷酸钙、阳离子脂质或阳离子聚合物是最常用的转染试剂。当旨在实现 高细胞密度 培养以进行大规模生产时，磷酸钙存在一定的缺点，因为它需要含有血清的培养基以抵消 Ca₃(PO₄)₂颗粒的细胞毒性作用。此外，Ca₃(PO₄)₂颗粒促进聚集，使其用于 高细胞密度 培养时变得较为复杂。脂质介导的策略，如使用 Lipofectamine 以及衍生产品，是一种有效的转染方法。它们作为 DNA 载体通过脂质体的形成将其引入细胞。DNA 与阳离子脂质体混合，产生含有目标 DNA 的、带正电荷的脂质囊泡。这些囊泡与带负电荷的细胞膜相互作用并融合，将 DNA 释放到细胞质中。然而，它们在质粒从胞质溶胶转移到细胞核的步骤中存在不小的瓶颈。此外，这些分子的高价格阻碍了这种方法在大规模生产中的充分利用，其使用仍停留在实验室规模以及研究用途。

对 TGE 的广泛研究反映在使用阳离子聚合物介导的转染的研究数量上，明显超过任何其它方法的报告。阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺 (PEI)，工作方式不同。它们是带正电的分子，与 DNA 复合，形成带正电的复合物，与细胞膜相互作用。内吞作用后，DNA:PEI 复合物离开内体区室并由于 PEI 的缓冲能力而释放到细胞质中，这导致细胞内内体的塌陷。然后，复合物需要到达细胞核。与其它方法相比，PEI 的使用在可放大性、细胞毒性和可重复性方面具有明显的优势。基于脂质和基于 PEI 的策略都依赖于类似的途径将 DNA 递送到受体细胞，这两种方法是报告观察到 CDE 结果的、基于 DNA 复合的主要TGE 策略。使用这些方法时，报告的CDE 的主要特征是，在转染更高的细胞密度时，转染效率降低。已经有研究尝试跳过 DNA：PEI 复合步骤，以避免 CDE，并实现更高细胞密度的成功转染。尽管可以使用基于 DNA 复合的瞬时表达系统可以在 高细胞密度 条件下实现转染，但转染效率会降低，并且仍然是大规模瞬时生物生产的主要挑战之一。

电转也是一种瞬时表达的方法，由于其操作要求，通常在小规模条件下使用。由于使用电转容器或微流体装置需要将细胞浓缩在小体积中，因此使用的细胞密度为 0.5 - 2 x 10⁶ cells/mL。这阻碍了这种方法的规模放大以及在工业生产中的大规模应用。最近的研究取得了一些进展，其中，流式电转的实施允许在 2.8 L 的体积中成功电转 10⁷cells/mL的培养。然而，后续培养基置换步骤的要求以及进一步规模放大的难度，已经将电转转变作为小规模条件下转染困难的产品的替代方法，专注于单细胞电转。据我们所知，电转尚未在高工作细胞密度下得到充分研究，也没有报道过关于 CDE 的观察结果，因为其应用的条件和要求不会导致 CDE 的出现。

使用病毒载体进行瞬时表达在生物工艺领域得到了广泛的推广。这些系统的主要缺点是需要一直依赖于病毒的扩增、滴度检测、储存和操作，导致生物安全问题。然而，旨在防止复制的修饰及减毒病毒的设计为使用病毒载体进行 TGE 铺平了道路。此外，Joshi 等人最近介绍了杆状病毒表达系统在生物工艺领域中用于病毒载体的瞬时生产的良好稳定性。杆状病毒系统的优点是可以将其与昆虫细胞系，如 Sf9 和HighFive， 或将其用于哺乳动物细胞系中，进行重组蛋白的 TGE，其无法复制，故而被视为生物安全优势。这两种策略都提供了可放大的高产量生产，尽管仍然依赖于昂贵的重组杆状病毒的产生。与基于 DNA 复合的 TGE 策略不同，CDE被报道为在使用病毒瞬时表达系统时，随着细胞密度的增加，病毒载体的细胞特异性生产力降低。在使用杆状病毒表达系统生产 AAV 时，观察到了这种降低。尽管与 低细胞密度 生产相比，生产是在更高的细胞密度下实现的，并且总滴度有所提高，但细胞特异性生产力却降低了。此外，用于病毒载体生产的生物工艺，例如用于哺乳动物细胞培养中疫苗开发的腺病毒或流感病毒，在感染前在生物反应器中生长至高细胞密度，也报告了针对更高细胞密度的相同效果。这种效应已在所有哺乳动物、禽类和昆虫细胞平台中得到报道。它们面临的主要共同挑战之一是，在高细胞密度下进行感染时保持细胞特异性生产力或细胞特异性病毒产量的能力。本文将重点关注自 CDE 在科学文献中首次提及以来，直至最近，旨在揭示问题根源的组学研究报告。最后，分析已报道的缓解 CDE、在 高细胞密度 下实现成功瞬时表达的不同策略。

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原文：J.Lavado-Garcia, P.Perez-Rubio, L.Cervera, et al., The cell density effect in animal cell-based bioprocessing: Questions, insights and perspectives. Biotechnology Advances, 2022, 60:108017.