用于灌流的搅拌罐生物反应器的规模放大_行业资讯_媒体中心

连续灌流培养通常使用与内部或外部细胞分离装置耦合的搅拌罐生物反应器。前文已经讨论了细胞分离装置的可放大性，这里将重点关注搅拌罐的放大。哺乳动物细胞培养需要特定的工艺设计和设备布局，因为它们具有独特的特性，主要与对剪切、（非生理）CO₂浓度和环境条件变化的高敏感性有关。在下文中，我们将讨论关键的放大条件 - 即适当的混合、充分的氧气传输以及在低剪切率下充分去除CO₂。我们将介绍把工艺设备的特性与工艺知识相结合的不同方法，以确定灌流培养的最佳操作范围。

传统的规模放大策略基于经验而不是定量科学考虑。通常，在放大过程中，每个规模都会调整与规模相关的参数，例如搅拌速度和气体流量。这是一种非常费力的方法，因为它需要在每个规模上进行适当的临时实验工作。

另一方面，与规模无关的参数可以在反应器规模缩小模型中定义，然后在规模放大期间实施。这包括最大流体动力应力、最小O₂供应和CO₂去除率等参数，这些参数可用于定义每个规模的细胞依赖性操作条件范围。搅拌速度和鼓泡强度是纠正放大问题的宝贵工具。然而，有必要通过进行旨在模拟大规模条件的小规模研究，来系统性地解决这些问题，以研究对细胞行为可能产生的不利影响。对此，不同规模的几何相似性可以为相关参数的确定提供适用的工程规则 - 例如平均能量耗散率、混合时间和气体传质率。然而，在实践中，整个生物制药行业所采用的生物反应器通常相当多样化的，这阻碍了简单几何缩放规则的应用，并且需要对关键放大参数进行实验测量或计算评估。

通气

氧气是哺乳动物细胞培养的关键底物，特别是在灌流模式中的高细胞密度需要非常大的氧气传输率。氧气在基于水的培养基中的低溶解度使得连续供氧成为必要条件。供氧率必须与细胞耗氧率相平衡；否则，溶氧 (DO) 浓度可能会低于临界值 - 通常，约为空气饱和度的 1% 至 10% - 导致细胞新陈代谢发生变化，从而对产品质量和数量产生负面影响。然而，如前文所述，氧浓度升高（例如，在纯氧通气的情况下）可能会刺激活性氧的产生，从而改变细胞代谢或导致细胞死亡。为此，有必要将细胞培养保持在最佳溶氧范围内，通常为空气饱和度的 40% 至 60%。

一般来说，在有利的供氧条件下，动物细胞系表现出的细胞特异性耗氧率在 0.05 到 0.5 × 10^-12 mol/cell/h 的范围内。考虑到 1.0 - 2.0 × 10⁸ cells/mL 的目标活细胞密度，灌流培养中的总摄氧率范围在 5 到 100 mol/m³/h 之间，这与酵母或细菌培养没有太大区别。这意味着哺乳动物细胞灌流生物反应器需要由单位体积传质系数 k_La [h^-1] 和驱动力 ΔCO 的乘积给出的高氧传输率 (OTR) 值。

C*_O2表示细胞培养中饱和DO浓度 – 亦即，该值与气相中的氧气浓度相当 – C_O2表示液相中的实际DO浓度。C*_O2的最大值为1 mM，对应于纯氧以1 atm通入生物反应器的情况。生物反应器操作中的典型DO浓度约为空气饱和度的50%，对应于0.1 mM的浓度。考虑到前面提到的哺乳动物灌流生物反应器中需要的OTR，可见传质系数值应该在5到100h^-1的范围内。

k_La的值取决于多个不同的因素，但主要取决于气体的表观速度，VS，以及通过搅拌器和气体鼓泡转移到液体的平均总能量耗散率。第一个消耗的能量由搅拌器的转速和几何形状确定的，而第二个传递的能量主要受液体密度和表观气体速度的影响，后者定义为单位体积气体流速 Q_g 与生物反应器横截面A之间的比率：

一般而言，就能量耗散率而言，气体鼓泡的贡献很小，因为会应用低空气流量，以最大限度地减少气泡破裂对细胞造成的损害。事实上，能量输入在充气条件下由搅拌器控制，通常与搅拌器转速和直径、培养密度和反应器内液体体积有关，如前文所述。

尽管有其它通气技术 - 例如膜通气、表面通气或使用氧载体或全氟化碳 - 气泡通气，也称为鼓泡，不仅是向细胞培养引入和去除气态营养物质和挥发性副产物的最常用方法，也是实现最高传输率的一种。选择合适的鼓泡装置代表了最大化气体传输率（氧气供应和二氧化碳去除）与最小化细胞损伤和泡沫形成之间的折衷。开管式鼓泡、环形鼓泡和微型或熔块鼓泡是最常用的通气装置。第一个是简单的末端为喷嘴的管道，空气通过该喷嘴引入容器，从而适度控制通过喷嘴的气泡大小、直径和位置以及气体流速。

然而，这种装置通常会产生大气泡，因此被称为大泡。这种装置的优点是最小化起泡和细胞死亡，但大泡的单位体积-表面积比低，不支持高传质速率，因此需要高气体体积流量，以保证足够氧气供应。更先进的配置是环形鼓泡，由具有环形形状的管和许多具有特定直径的孔组成，通常约为 1 mm，允许同时产生多个气泡。另一方面，在微泡中，多孔材料用于产生大量微米级别的、非常小的气泡。由于较大的特异性气液界面表面积，微泡是传质的理想选择。然而，使用此类鼓泡导致二氧化碳脱气减少以及更多泡沫的形成。很多时候，一个合理的解决方案是结合一个微泡和一个大泡，并使用消泡剂来防止起泡的负面影响。此外，剪切保护剂，例如 Pluronic F68，可以防止由液体表面的气泡破裂引起的细胞损伤。另一方面，通过添加消泡剂来防止泡沫形成可能会导致传质速率降低。

搅拌

需要在生物反应器中混合，以均匀分散细胞、营养物质和气泡 - 以及添加的液体，例如基础或营养补液 - 以避免生物反应器内的空间变化或梯度，这可能会损害细胞。通常，这是通过机械搅拌和通气向细胞培养液中添加能量来实现的。在理想情况下，这种能量应该均匀地传递到培养物中，以便：

如前所述，随时间变化，每个细胞都暴露在相似的混合强度下。
营养物质、代谢物和副产物均匀分布在整个反应器中，因此细胞不会发生任何变化，并保持其代谢不变。

从这些考虑可以看出，为了在保持细胞活性的同时提供适当的细胞培养条件，所有规模的混合系统都需要适当的设计。例如，不适当的混合设计可能会使细胞在反应器底部沉降，从而产生质量和能量传递有限的区域以及完全不同的环境。另一方面，“激进”的混合也会对细胞产生负面影响，因为细胞所经历的剪切应力会导致细胞生长抑制、降低特异性生产力或诱导细胞死亡。需要对反应器系统在混合和功率输入方面的工艺和化学工程理解- 如果需要，与计算工具的应用相结合 - 以实现跨规模的平稳技术转移。

在生物技术和生物制药应用中，选择的反应器系统是各种规模的经典搅拌容器：从实验室到大型商业化规模。这种系统内的混合受到容器几何形状、各种形状挡板的存在以及搅拌器的几何形状和旋转速度的强烈影响。所有这些导致不同的能量耗散率和混合特征时间。

就几何形状而言（参见图 5.2），生物反应器可以看作是一个普通的搅拌容器，其特点是适当的无量纲纵横比，在反应器放大时要保持几何相似性。典型的几何参数包括罐高度 (H) 与罐直径（T）的纵横比H/T = 2 – 3。在中央，传动轴从顶部或底部伸入罐，连接到外端的电机，而在内部，一个或多个搅拌器连接到同一轴。在最常见的配置中，叶轮直径 (D) 与罐直径的纵横比在 D = 0.3 - 0.5 之间。细胞培养液的填充高度(HL) 应在 0.7H 左右，导致填充高度和罐直径的纵横比在 HL/T = 1.0 - 2.0 之间。对于搅拌器的位置，与罐底的距离等于 C = 0.1 - 0.3T 似乎是一个合理的选择。在罐内使用多个叶轮的情况下，它们之间的距离 (ΔC) 可以调整，但通常在一搅拌器直径左右。

图5.2 生物反应器的标准几何示意图，显示最重要的尺寸和纵横比，这在罐规模放大过程中必须进行考虑。

除了反应器的几何形状，搅拌器的选择代表了反应器设计中的一个重要步骤，因为可以使用的各种形状导致完全不同的混合特性。常见的设计包括径向流搅拌器，如 Rushton 涡轮 (RT)，提供高水平的强烈混合、高局部剪切率和以径向为主的流动模式，以及下泵轴流搅拌器，如螺旋桨，这导致相对于 RT 的改进的轴向整体运动。轴流式或斜叶式涡轮机产生居于两者之间的某种流动模式。

搅拌器的选择取决于多个考虑因素，特别是它的特异性功率数 (P0)，它与搅拌器类型本身及其相对尺寸 (D/T) 和罐中位置 (C/T) 有关。对于叶轮，功率数可用于计算耗散到系统中的能量 P，在相对于反应器体积进行归一化后，可得出特异性能量耗散率。

比较径流式叶轮和轴流式叶轮，可以看出第一种叶轮通常具有较高的单位功率，因此被称为高剪切叶轮，而第二种叶轮具有相对较低的单位功率，因此被称为作为低/中剪切叶轮。由于动物细胞的剪切敏感性，低/中剪切叶轮通常是此类培养的首选。然而，高剪切叶轮，如 Rushton 涡轮机，允许在相当低的叶轮速度下破坏和完全分散气泡，因此通常用于实验室规模，而低/中剪切螺旋桨则更受生产规模青睐。对于所有类型的叶轮，在叶轮附近测得的最大局部单位能量耗散率与罐本体中的平均能量耗散率相比相对较高，这就是我们所说的混合异质性，是反应器放大的一个关键方面。

在大型单元中，通常将多个叶轮连接到单个搅拌器轴上，以优化整体混合性能。两个这样的叶轮之间的典型推荐距离在叶轮直径的一到两倍之间，以便两个叶轮的流动模式不会相互干扰。使用挡板可以进一步提高混合效率，挡板垂直于罐壁，在容器周围以 90° 的间隔放置。在存在挡板的情况下，可以打破大漩涡，从而获得更好的混合条件。

流体动力应力

如前所述，能量需要消散到生物反应器中，以在混合和传质方面达到令人满意的条件。然而，这不可避免地会产生剪切应力，我们需要确保其对细胞无害。在工艺规模放大的框架中，可以方便地考虑与规模无关的变量，如传质速率和总能量耗散率，而不是规模相关的变量，如搅拌速度和通气速率。事实上，我们希望在放大规模的过程中改变第二类变量，以保持第一类不变。

在本节中，我们将讨论剪切应力对细胞活性的影响。一般来说，哺乳动物细胞表现出对流体动力应激适当的抵抗力，最大可耐受压力阈值高度取决于细胞系。为此，需要有一个通用程序可以方便地确定任何给定细胞系和任何给定实验设置的最大可耐受阈值。从监管的角度来看，这一点更为重要，并且与质量源于设计的方法相一致。在台式和大型生产设备中，具有相似的流体动力学、以实现相似的工艺性能至关重要。

在多相系统中确定最大流体动力应力确实很困难，尤其是在生物反应器系统中。计算流体动力学是一种选择，但在存在多相和复杂几何形状的情况下，其应用并不简单。Villiger等人(2015) 开发了一种简单的实验方法，可以应用于任何规模的任何搅拌容器，实际上，也可以应用于任何其它类型的单元，如泵、过滤器或其它设备。它基于使用通过单体匮乏的半批次乳液聚合合成的聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 纳米颗粒的悬液。最初的悬液在容器中通过搅拌和添加明确数量的氯化钠溶液（高于临界凝固浓度（CCC））来聚集，以使悬液不稳定并促进纳米颗粒的聚集以及聚体的形成。

然后用去离子水稀释这种尺寸明确的聚体，以防止任何进一步的聚集并获得稳定的聚体悬液。这里的想法是，这些聚体很脆弱，如果受到一定的剪切应力，可能会破裂，实际上，它们受到的应力越高，它们达到的尺寸就越小。因此，可以将这种悬液引入任何反应器或其它类型的装置中并循环足够长的时间，以便在达到稳态尺寸之前发生破裂。然后可以测量它们的最终尺寸，例如，通过小角光散射 (SALS)，这提供了对聚体在生物反应器内经历的最大剪切率的检测。显然，这并没有告诉我们任何关于在单元中发生这种最大剪切的位置，而只是告诉我们设备中某处的聚体经历的最大剪切是多少。为了获得对此的定量估计，我们显然需要一条校准曲线，以从测量的聚体尺寸推导经历的最大剪切值。特别是，他们使用了在各种直径和流量的收缩喷嘴入口处产生的轴对称拉伸流动。

相应的剪切速率通过计算流体动力学计算。因此，通过将计算的剪切值与循环 PMMA 聚体悬液时、在同一设备中测量的聚体尺寸相关联，可以构建所需的校准曲线。该技术用于在具有给定容器直径、Rushton 涡轮叶轮和四元挡板配置的经典搅拌罐反应器中，针对各种叶轮转速和空气流量进行的一系列实验。对于给定的搅拌罐反应器，在给定的操作条件下，获得的最大有效流体动力应力τmax 值与文献数据非常一致。

图 5.3 由 Villiger 等人（2015年）开发的剪切敏感 PMMA 系统测量的 300 L 生物反应器中的最大流体动力应力。在不同的搅拌速度和气体流速下研究了两种类型的鼓泡，一种具有 1 mm 开口喷嘴，另一种具有 50-μm 烧结鼓泡。空心方块对应于非充气单相条件。喷嘴鼓泡的应用气体流量等于 0.03 vvm（实心圆圈）和 0.09 vvm（实心三角形），而对于 50-μm鼓泡，气体流量等于0.03 vvm（灰色圆圈）。

Neunstoecklin等人 (2016) 使用这种实验方法来确定搅拌和通气对 300 L 生物反应器中最大流体动力应力的相对重要性。为此，测量了搅拌和鼓泡系统的各种组合的 τmax。特别是，考虑了位于 Rushton 叶轮下方的两种类型的环形鼓泡：一种具有8个烧结鼓泡（平均孔径等于 50 μm），另一种具有8个直径为 1 mm 的喷嘴。得到的结果如图 5.3 所示，不同的通气流量与搅拌速度有关，用雷诺数表示，定义为 Reimp = ρLND。可以看出，非充气条件下的最大流体动力应力随着Reimp 的增加呈对数-对数规模线性增加。当考虑低气体流速（即 0.03 vvm）时，使用烧结鼓泡时的 τmax 测量值与单相条件下测量的值相当，表明小气泡的贡献可以忽略不计。相反，当使用产生较大气泡的 1 mm 开管系统时，τmax值在低 Reimp 时增加到约 5 Pa，气体流速为 0.03 vvm，甚至更多，对于 0.09vvm的较大气体流速，约为8 Pa。通过增加叶轮速度，τmax 的值在所有情况下都会增加，但在 Reimp 值足够大时，鼓泡的影响会降低并变得可以忽略不计，其中最大流体动力应力由叶轮产生的湍流支配。

图 5.4 Neunstoecklin 等人（2015）使用的 3 L 生物反应器系统的设置和几何结构在细胞上产生波动的流体动力应力。不同直径的鼓泡用于产生不同的剪切率最大值。所有给定值均以cm为单位。

Neunstoecklin等人 (2015) 使用这种技术来确定哺乳动物细胞培养中不同细胞系（CHO 和 Sp2/0）的最大工作流体动力应力。作者建立了一个规模缩小模型，来确定流体动力应力的阈值，该模型是根据不同的细胞特征（即细胞活性、生长、形态、代谢和生产力）进行评估的。特别是，其使用了一种改进的生物反应器装置，以使细胞暴露于不同且明确定义的流体动力应力，如图 5.4 所示。除了典型的搅拌容器外，该装置还配备了一个外部回路，由一个非接触式离心泵驱动，包含一个喷嘴。用喷嘴将细胞培养液泵送通过外部回路，向细胞施加振荡的流体动力应力，类似于它们在大型生物反应器中经历的情况，喷嘴中的高应力代表搅拌器附近的区域，而搅拌容器中的较低应力代表远离搅拌区域的主体区域。循环中的暴露时间设置为 90 秒，这与细胞在 5,000 L 生物反应器中具有大流体动力应力的区域中的暴露时间相关。通过改变喷嘴直径，可以施加不同大小的流体动力应力。因此，通过在单元内循环 PMMA 聚体悬液并测量相应的平衡尺寸，以及使用校准曲线，可以估计单元内聚体（相当于细胞，因为它们具有非常相似的尺寸）经历的最大剪切。

在用不同尺寸喷嘴通气的生物反应器中培养 24 小时后测量的细胞活性下降与图 5.5 中显示的两个考量的细胞系的最大测量剪切应力有关。可以看出，细胞活性不受低于临界值的剪切应力值的影响，而高于该临界值时，细胞活性降低。

图 5.5 基于 CHO (A) 和Sp2/0 (B) 细胞系在培养的前 24 小时内的活性下降的临界应力确定示例（虚线箭头）。

这种行为在两种细胞系中都很常见，对于 CHO 细胞系，最大可耐受阈值在 τmax 为 32 ± 4 Pa，对于 Sp2/0 细胞系为 25 ± 2 Pa。Neunstoecklin 等人(2016) 在更大的 300 L 中试规模生物反应器中对给定的 Sp2/0 细胞系进行了验证实验，该反应器以不同的搅拌和通气速率运行，以模拟 7 至 28 Pa 范围内的流体动力应力条件，并证实，生长行为、代谢物浓度、生产力和产品质量显示依赖于不同的环境压力条件，与反应器规模无关。虽然这项研究是在补料分批培养中进行的，但类似的概念也有望应用于灌流条件。最大可承受应力τmax 实际上是细胞特异性的数值，而不是工艺特异性的数值，因此，预计它适用于批次和连续操作，也不适用于不同规模的操作。

计算流体动力学

我们已经看到了在混合、通气和剪切应力方面表征不同规模的生物反应器的重要性，并讨论了几种测量相应相关量的实验技术。在下文中，我们将简要讨论通过数值模拟（即使用计算流体动力学 (CFD)）确定相同量的可能性。CFD 的主要优点是提供整个反应器中所有局部量的估计，从而在时间和空间上提供反应器异质性的完整描述，这与商业规模的生物反应器特别相关。计算流体动力学提供了一种有价值的工具，用于评估各种几何形状和尺寸的各种反应器系统以及不同操作条件下的这种异质性。

该方法应用数值技术来求解描述生物反应器内流体运动的方程。Navier-Stokes 方程建立了 CFD 的基础，其中包含质量、动量和能量守恒的表达式。离散化技术的使用能够求解一组有限体积的不同方程，并产生离散流场。假设，例如稳态或无粘性流动，简化了解决方案并加速了解决方案的收敛。

典型的 CFD 分析包括三个阶段：

使用适当的网格划分和边界条件以及有关流体特性的信息来构建模型。
通过离散化求解各种动量、质量和能量平衡方程，并以某种便于分析的形式产生结果。
以向量和等高线图的形式解释数据，以提取所需的信息。

特别是，计算的 CFD 和实验确定的值的比较可用于验证获得的结果。有各种商业 CFD 软件可用于计算流体动力学模拟，这极大地简化了后两个步骤。这是一种相对先进的软件，可以为生物反应器选择合适的模型，模拟各种几何形状和不同叶轮的旋转，并模拟反应器内的层流或湍流条件。软件使用取决于生物反应器尺寸的网格尺寸计算产生的流场。此外，可以模拟压力、动量、湍动能和耗散率，从而计算流体动力应力的时间和空间分布。CFD 也可用于模拟无质量示踪剂的轨迹，例如，重现前面描述的一些混合实验，然后比较计算和实验获得的特征混合时间。在 CFD 最常见的应用中，我们可以通过估计不同的水动力特性和不同的流动状态，列出不同类型生物反应器内 k_La 值的确定、不同生物反应器状态下的水动力、局部能量耗散率以及最佳叶轮位置，。当然，根据所需模拟的详细程度和系统在相数、稳态或瞬态行为以及要模拟的对象的整体大小方面的复杂性，所需的计算时间可能会显著增加，甚至变得不可行。为此，可以引入各种技术来减小过程的规模- 例如，使用伪相或将整个反应器体积划分为不同的区域。原则上，CFD 不仅可以成功地应用于获得对给定生物反应器配置中发生的不同过程的基本了解，还可以优化操作条件以及规模放大过程中生物反应器的设计。

本文为以下文献内容简介，详细内容，请参考原文。本文旨在知识、信息分享，转载请注明出处和原文。

原文：Perfusion Cell Culture Processes for Biopharmaceuticals Process Development, Design, and Scale-up , pp. 100 - 137

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用于灌流的搅拌罐生物反应器的规模放大

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