本章节主要讨论了Perfusion工艺设计、开发和优化的策略。所述策略包括perfusion过程的基本步骤和工艺边界；Perfusion的克隆和培养基筛选，使用缩小模型进行比较；表达系统确定后，对反应器的操作条件进行设计，以最大限度地提高体积产率生和收率，同时减少培养基的消耗；生物制剂和生物仿制药产品CQA的基本问题以及perfusion操作方式的影响。文章最后讨论了临床到商业生产过程中工艺开发和放大的主要目标。
Perfusion工艺的实施涉及到生产成本、产品质量及工艺的鲁棒性。最合理的工艺开发起点可能是选择最大的体积通量，同时最大限度地提高生物反应器内的生物量，以提高过程的经济性。体积通量以灌流速率表示：P (RV/day)，与活细胞密度XV(million/mL)的比值，定义为细胞特异性灌注速率：CSPR (pL/cell/day)，CSPR表示每天供给单个细胞的培养基量，降低CSPR是工艺设计的一个重要因素。Perfsuion工艺的稳健性设计包括：首先选择合适的克隆和培养基；其次，确定一个合适的低CSPR，理想情况下即CSPRmin；最后确定在给定CSPRmin条件下VCD和灌流速率的最佳操作条件。反应器中的系统变量如pH、DO、搅拌、工作体积、进出端流速、VCD等需要加以控制，控制策略的实施需要定义适当的上下工艺边界，上下工艺边界的确定与VCD、CSPR尤其相关。
灌流速率：工艺上限主要由两方面因素决定：操作的可持续性和经济性。灌流速率的上限：细胞保留装置不能承受太高的灌注速率，因此产生限制性，而另一方面，高灌流速率意味着高培养基消耗，提高了操作成本，在工艺开发中常用P(RV/day)参数表示灌流速率。灌流速率的工艺下限取决于多种因素，包括细胞特异性生长速率、培养基配方和成本以及产品的稳定性。低灌流速率导致产物在反应器中停留时间长，翻译后修饰的变化对产品的CQA产生负面影响。在细胞密度一定的情况下，随着灌注率的降低，细胞可达到代谢物水平，低于此水平由于会诱导细胞死亡、细胞特异性生产力或产物质量下降等原因而不可能进一步培养。
活细胞密度VCD：通常考虑较大的目标VCD值，因此只需要考虑操作的工艺上限。除了CSPRmin(在给定的VVD下)限制了VCDmax外，其他限制来自溶解氧限制、细胞培养液的粘度和细胞截留装置。在CSPRmin以下的细胞培养是不稳定的操作，对于给定的P，VCDmax受所使用培养基深度（medium depth）的限制，这决定了CSPRmin; 另一方面，与Batch培养模式相比，perfusion通常具有更高的VCD，这意味着更多的氧气消耗和二氧化碳产生，当目标VCD超过100M时，尤其需要考虑气体的传质限制。与高细胞密度相关的另一个限制性因素是培养基粘度的增加，这将导致更高的搅拌速率，以保证反应器中混匀效果，而高搅拌速度会导致细胞剪切力损伤。细胞截留设备也可能会对细胞密度值产生限制，这些限制可能与细胞在截留设备中不受控制的环境中停留时间、设备本身的特性：如相对于切相流过滤所使用的的泵速及过滤介质的孔径结构相关。CSPR：CSPRmin是最重要的perfusion参数，受培养基组成和表达系统影响，对应不同细胞系和克隆有较大的变化，早期培养基和克隆筛选是perfusion过程设计的先决条件。qp/μ：对于一个表达系统，在给定的P，VCD，CSPR条件下，细胞代谢理论上是固定的：可用细胞特异性表达量qp和细胞比生长速率μ进行表征。
以上参数对于定义一个perfusion的表现非常重要，包括产率、培养基消耗和产物收率（参数值是由细胞代谢决定的，是温度、pH值和上清液成分，尤其是对应营养物质和有毒代谢物的函数）。在培养基深度足够时，qp并不依赖于CSPR，只要不出现营养限制，CSPR可以在不改变qp的情况下降低，而在其他情况下，CSPR的降低会使细胞培养会变得不稳定。μ随着CSPR减小而减小，在CSPRmin条件下下，μ是最小的，但也足以支持细胞培养。
在生物反应器稳态操作下，生物反应器的性能由如下三个参数表征：体积产率(PR)，产物收率（Y）和培养基消耗（MC）：
▲P：VVD（RV/day）、B：bleed rate(RV/day)、Cp(g/L)稳态操作条件下，bleed速率等于细胞生长速率μ：
当我们设计一个perfusion工艺时，通过上述参数去考察工艺表现，暂时不考虑产品质量。PR和Y需要最大化，MC需要最小化。由于bleed显著影响产物收率，因此Y公式中μ要尽量小，而最小μ对应CSPRmin，一般来说bleed在5-10%，以保证收率在合理范围内。当考Y和MC时，CSPRmin是工艺操作最优点。确定CSPRmin有两种方式，push to low：在恒定的VCD条件下减少P；push to high：在固定的P条件下增加VCD。两种方式的区别：第一种P降低，导致残留时间增加，针对不稳定的分子需要注意，第二种方式，VCD增加，可能出现不可实现的最大VCD值。两种情况下，CSPR降低直到培养基消耗或代谢抑制导致的perfusion过程出现不稳定性（例如细胞衰亡或qp降低）。
▲push to low 和push to high确定CSPRmin的示意图。红点表示过程的初始条件，虚的斜率表示CSPR值
如果P恒定，优化过程包括以下步骤：选取合理的P和XV作为初始条件，测量稳态下的PR和MC。通过增加VCD，push to high可以增加PR，降低MC，直到CSPR等于CSPRmin。下图所示为P恒定为1.0 VVD时的perfusion工艺开发和表现。
▲perfusion设计的第一步:在恒定灌流速率下push to high，灌流速率1.0 VVD，qp 为25 pg/cell/day。A: 不同CSPR值下灌注速率与VCD的关系；箭头表示恒定P下增加VCD时，CSPR下降(从100 pL/cell/day下降到20 pL/cell/day)；B：VCD 、CSPR，灌流速率(黑线)和bleed率(红线)与时间的关系；C：PR(黑色)和MC(红色)和VCD的关系；D：收率作和VCD的关系。第2个步骤是在CSPR固定条件下（CSPRmin），改变P和XV，考察工艺目标PR、Y、MC的变化。
从以上公式中可以看到：在恒定的CSPR(qp和μ也保持恒定)下，随着灌流速率（P）的增加，PR和Y增加，MC减少，因此最佳P是Pmax所能维持的最大值；增加活细胞密度XV也可以得到相同的结果，因此，使用可达到的最大XV或最大可维持的P来描述最佳工艺操作条件。如图下图所示，固定CSPR为20 pL/cell/day的情况，图A为固定CSPR条件下VCD与P的关系。结果显示，P为1-5.0 RV/day对应XV在50 ~ 250M；图B假设该系统的μ恒定，bleed为0.1 RV/day，qp为25 pg/cell/day，计算出Cp为1.25 g/L。由此，利用以上公式可以计算得到PR、Y、MC对应P的曲线。图C中，PR随P从0.5 g/L/day上升到6.1 g/L/day，而MC从1.0 L/g下降到0.82 L/g。特别是在P较低的范围内，例如在0.5 ~ 3.0 RV/day之间，增加P对MC降低有很强的效果，而在P值较高时，这种效果不再显著；另一方面，重要要考虑的是在P高于3 RV/day的条件下（特别是XV大于100M时(等于2 RV/day，CSPR为20 pL/cell/day)）生物反应器操作的稳定性。图D中可以看到，随着P从0.5 RV/day逐步增加到2.0 RV/day，Y从80%增加到96%，然后增加速率变缓，直到随着P的进一步增加，可降低至98%。
▲恒定CSPR下perfusion工艺设计的第二步。恒定的CSPR为20 pL/cell/day，固定的bleed率为0.1 RV/day，细胞特异性产率为25 pg/cell/day。A：当CSPR值为20 pL/cell/day时，灌注率与VCD之间的关系 ；B：VCD、 CSPR，灌注速率和bleed随时间的变化。C：PR、MC与灌流速率的关系。D：Y与灌流速率的关系。以上表明了在恒定CSPR条件下进一步优化的重要性，perfusion过程具有很大的优化潜力，同时必须考虑到工艺操作的可行性约束。Pmax的取决于表达系统、所选培养基和反应器。结合以上的分析，perfusion工艺开发分为两个步骤：CSPRmin的确定，Pmax及VCDmax的确定。
