重组蛋白生产细胞株稳定性研究
[2021-05-28 14:44:30]
哺乳动物细胞培养技术已成为21世纪生物制药企业立足全球生物制药界所必须掌握的核心技术。细胞株是哺乳动物细胞培养技术关键原物料，优质的细胞株不仅能降低项目失败的风险，而且还能降低药物研发成本，开发高产且稳定的细胞株是生物制药企业面临的重要研究课题。本文旨在讨论重组蛋白生产细胞株稳定性研究内容，希望能引发同行相互讨论。由于动物细胞具有易塑性，它对外来插入的基因表现出极强的耐受性和适用性，这一方面有利于基因操纵，达到让细胞表达人们期望的目的蛋白；另一方面也决定了细胞株不可能长期稳定的生产预期的目的蛋白。因此，对细胞株进行稳定研究不仅是保证药物质量符合标准的基本前提，也是各药企必须严格要求开展的研究内容。中国药典、FDA、EMA、ICH等相关指南文件均对细胞株稳定性提出明确的要求。例如《中国药典》 2020版三部中提到：“细胞种子有一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过鉴定证明适用于生物制品的生产或鉴定”。通过解读现有法规指南文件，对细胞株的要求重点强调两个方面：一个是生产的细胞株必须是单细胞来源，另外一个是生产的细胞株需能满足稳定而连续生产。这两点始终贯穿于细胞株开发的整个过程，且当生产工艺变化时需要重新开展细胞株稳定性研究。稳定细胞株的构建通常包含：载体构建、转染、Pool筛选、克隆筛选、PCB建库、MCB/WCB建库、细胞株稳定性研究等内容，如下图细胞株开发时间安排表所示。通常筛选到合适的细胞株才能进行后续的工艺开发和蛋白生产活动，所以稳定细胞株的开发是药物研发的限度步骤。由于细胞转染具有随机性，通过各种规模的筛选工作挑选出将目的基因插入到染色体中特定位置的细胞，并通过连续传代稳定性研究经一步确认目的基因的表达稳定性。最终确定出产量质量符合要求且能稳定生产的细胞株。一个理想的生产细胞株通常具备的高产、单克隆、可放大、稳定、产品质量合格等基本特征。细胞株稳定性研究的目的是确定出细胞限传代次，确保在限传代次内其表达产物的质量和产量符合预期的要求。通常在IND申报阶段和BLA申报阶段对细胞株稳定研究的要求有所区别。在IND申报阶段：采用PCB开展有限的细胞株稳定性研究，可在摇瓶或者反应器规模下开展，其实验内容是将PCB种子细胞在特定的条件下进行传代，通常在传至第5代、10代、15代、20代时进行细胞冻存，最后将各个代次冻存的细胞进行复苏，采用当前的工艺进行培养生产。该阶段重点关注各代次的细胞生产、代谢和产量的稳定性，如已经开发出合适的分析方法，可同时对关注质量属性进行评估。在BLA申报阶段：此阶段要求更加严格，需要对MCB和WCB开展有限的细胞株稳定性研究，且需要在生产规模或者在经过验证的缩小模型中进行，其实验内容与PCB稳定性研究一致，将MCB和WCB种子细胞在特定的条件下进行传代，通常在传至第5代、10代、15代、20代时进行细胞冻存，最后将各个代次冻存的细胞进行复苏，采用商业化生产的工艺进行培养生产。该阶段重点关注各代次的细胞生产、代谢、产量、蛋白质量和遗传稳定。在不确定细胞系稳定性情况下，建议同时开展带有筛选压力和不带筛选压力的两组实验进行细胞稳定性研究。通常从以下四个方面来判断细胞株稳定：生长特性稳定、生产产量稳定、产物质量稳定、遗传稳定。生长特性稳定：各个代次（P1、P5、P10、P15、P20）细胞株在当前工艺条件下细胞生长和代谢应无显著变化。在实际项目运行中，通常会发现随着传代次数的增加，活细胞密度峰值也随之提升，出现各个代次的细胞生长曲线不一致的情况。此时若各个代次产量、蛋白质量、细胞遗传等指标均符合要求，并且活细胞密度峰值的增加不影响工艺的稳定性和可放大性，笔者认为也是可以接受的。生产产量稳定：各个代次（P1、P5、P10、P15、P20）细胞株在当前工艺条件下细胞表达的产物量应无显著变化。在判断细胞株表达量是否稳定时，没有法规规定表达量变化的可接受变化幅度，但是业界已达成一致，认为通常是最高的限传代次和初始研究代次间的表达量变化符合应该控制在30%以内，认为是可以接受的，即就表达量而言判断细胞株是稳定的。产物质量稳定：各个代次（P1、P5、P10、P15、P20）细胞株在当前工艺条件下产物质量应无显著变化。需要对各个代次的关键质量属性进行检测，例如聚体、酸性峰、糖型等，对比对最高的限传代次和初始研究代次的各个质量指标的变化来判定细胞株的稳定性。遗传稳定：各个代次（P1、P5、P10、P15、P20）的基因组序列和氨基酸序列应一致，且各个代次基因拷贝数无显著变化。基因组序列和氨基酸序列是一致是保证细胞株稳定的基本前提，有时候为项目进度需求也可以通过侧面来间接证明基因组序列和氨基酸序列一致，比如通过分子量分析和肽图分析等手段。根据稳定性研究结果明确生产的限传代次，以满足商业化生产的需求。对于常规的生产工艺来说，细胞种子扩增7～8代即可满足约20000L的生产，扩增5～6代可满足5000L的生产，如下表所示。由上表可知，商业化生产达到20000L时，只需要满足WCB在P0代和P8代稳定即可。所以对于大多数企业对比WCB P0和P10的稳定性数据即可满足要求。而对于PCB建立MCB，再从MCB建立WCB过程中通过会增加8至10代次，故理论上对于PCB稳定性研究需要开展P18~P20代即可满足WCB开展20000L规模的要求，如下表所示。综上，企业通常将WCB P10（PDL约为30）作为最高的限传代次，即可满足大多数项目的需求（除灌流培养工艺外）细胞株稳定研究是监管机构重点关注的内容。以下提供两三个真实的案例供大家参考。案例一：某国外药企在进行WCB稳定性研究是摇瓶规模下进行的，但是由于摇瓶规模和生产反应器规模的细胞生长、代谢、质量等方面存在较大的差异。监管部门建议，重新开展细胞株稳定性研究，需要在经过验证的缩小模型和生产规模下进行。案例二：某药企在进行生产工艺变更后，细胞株稳定研究采用之前的工艺作为最高限传代次的支持。监管部门提议重新开展稳定性研究，需要采用最终生产工艺进行细胞株稳定研究。案例三：某药企在开展细胞株稳定性研究时，未考察遗传稳定性研究内容。监管部门提议重新开展稳定性研究，进行遗传稳定性研究。
