使用本公司研发的个性化培养基对鸡肝癌细胞（LMH细胞）多代次的悬浮传代培养，考察细胞生长和FAdV-4扩增的稳定性。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数（MOI）、培养液稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。建立了LMH细胞悬浮培养扩增FAdV-4的生产工艺，操作简便，易于放大，为当前FAdV-4C疫苗的滚瓶生产工艺替代成大规模的反应器生产工艺奠定了基础。

      Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感，在我国鸡群中发病率较高，全国范围内均有流行，并且2010年后逐年上升趋势。Ⅰ群禽腺病毒的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。FAdV-4C属于Ⅰ群禽腺病毒，能引起的心包积水肝炎综合征(HHS)，导致产蛋下降甚至死亡(死亡率在20％～80％)。主要病理变化是心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，心脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵体。FAdV-4C对雏鸡的致病力最强，可通过接触水平传播及垂直传播，对我国养鸡业造成了严重的经济损失。

      LMH细胞（鸡肝癌细胞）对禽腺病毒病毒敏感性较高，成为腺病毒疫苗生产的最佳宿主之一。在我国，LMH细胞培养以贴壁细胞培养为主，操作繁琐且需要使用高比例进口血清，成本较高和批间质量不稳定等问题突出。乃至无血清的悬浮培养工艺则更具优势。然而，疫苗生产用的悬浮LMH细胞的传代稳定性尚未探明，LMH细胞悬浮适应后的产毒能力及相应的工艺也需要详细的实验研究。

      本文采用高产株的LMH悬浮细胞株作为出发细胞株，应用自主研发的培养基对其传代培养8个月，考察其在悬浮培养中生长的稳定性，并在摇瓶中建立病毒Ⅰ群禽腺病毒扩增工艺。

将生长无异常的悬浮LMH细胞按照接种密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml，每三天（72h）稀释传代，37℃摇床内培养，连续传代中考察细胞生长的稳定性。在摇瓶建立接毒工艺并优化MOI和稀释比例等工艺参数。

     摇瓶连续传代累计240天，细胞形态保持良好，表面光滑圆润，均呈大小均一的球形，稍有结团，每代次培养72h的细胞密度均可达到5.0~7.0×10⁶ cells/ml，表明该培养体系的传代培养稳定性较好，细胞培养状态如图1，传代200多天后的细胞生长曲线如图2。

图1  培养72h细胞状态图

 图2  LMH细胞生长增殖表

    MOI

    接种密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培养72h稀释接毒，置于37℃摇床内培养，相同稀释比例（即接毒密度）以不同的MOI进行接毒，每24h取样计数观察，留样检测TCID₅₀/ml效价，结果显示（图3）。MOI越低，接种病毒后所能达到的最高TCID₅₀效价（TCID₅₀max）出现时间越晚；相反，MOI越高，TCID₅₀max出现时间越早。MOI为0.5和1.0时，HAmax均在接毒72~96h较高，其中实验组基本均可达9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高达到9.5lgTCID₅₀/ml。

图3  不同MOI下，FAdV-4在LMH细胞中的增殖效果

     接种密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培养72h稀释接毒，置于37℃摇床内培养，相同的MOI=1.0下以不同的接毒密度（即稀释比例）接毒，每24h进行取样计数观察，并留样检测TCID₅₀，结果显示（图4）。接毒密度越低，接种病毒后所能达到的最高TCID₅₀效价（TCID₅₀max）出现越早，反之，接种密度越高，TCID₅₀max出现时间越晚，其中实验组基本均可达9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高达到9.33lgTCID₅₀/ml。

图4 不同接毒密度下，FAdV-4在LMH细胞中的增殖

        本研究表明本公司实验室驯化的LMH悬浮细胞在配套的个性化培养基中累计传代培养240天效果良好，其传代培养稳定，且细胞各代次细胞形态良好，表面光滑圆润，72h细胞计数可达5.0~7.0×10⁶ cells/ml；同时在最佳的接毒条件下（即最佳接毒比例或MOI），接种贴壁培养制备种毒(效价为7.8~8.3lgTCID₅₀/ml)最高效价为9.50lgTCID₅₀/mL，且本研究建立的悬浮培养体系在中试反应器悬浮培养放大生产中已经得到了初步的实践论证，为后续的大规模批次生产提供了技术思路与支持。