禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，A型流感病毒宿主极其广泛。A型流感病毒的致病性与毒株和宿主均有很大关系，不同毒株对同一宿主或同一毒株对不同宿主的致病性差异很大。H9N2亚型AIV在我国涉及范围最为广泛，发病率、死亡率低，但其危害也不容忽视。该病毒除造成禽呼吸道疾病外，还侵害家禽的生殖系统，使蛋鸡产蛋量急剧下降或者产蛋达不到高峰：肉鸡感染后生长缓慢，降低料肉比；H9亚型AIV易与其他病毒病(如鸡 新城疫等)或细菌病(如大肠杆菌病等)混合感染，可造成较高的死亡率。犬肾上皮细胞(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)对流感病毒敏感性高，成为流感疫苗生产的最佳宿主之一。本文对前期实验室已成功悬浮驯化的MDCK-10进行稳定性验证及产毒评估，再到动物实验。从摇瓶小试工艺开发，到中试及生物反应器大规模生产进行全方位的工艺摸索，从而更新现阶段以鸡胚为原料进行生产的固有工艺，为国内低致病性禽流感生产型企业进行全悬浮无血清大规模生产奠定数据基础。

   将指数生长期的悬浮 MDCK-10 细胞以1.5×10⁶cells/mL 左右的密度接种于康宁摇瓶中，装液量为摇瓶总体积的20-30%，置于 37℃、5% CO₂、130 r/min 培养箱中培养；后续连续传代为用新鲜培养基将细胞液稀释至 1.5×10⁶ cells/mL，每48h传代一次。细胞连续传代40代以上，进行细胞状态观察及数据汇总，为细胞连续稀释传代稳定性做数据支持。

    悬浮MDCK-10上罐14L玻璃生物反应器，培养体积6L，密度增殖至8-10×10⁶cells/mL，按新鲜培养基与细胞液体积比为1:1稀释细胞液，分别以万分之一培养体积比接种H9F6株、H9C1株、H9C2株、H9CD株，胰酶添加浓度为10μg/mL，控制反应器参数：温度：37℃；转速60rpm；pH7.15;DO：60%。培养48-72h后收取病毒液，冻融一次后取样测定病毒滴度。按终浓度0.1%的比例加入37%的甲醛溶液，至37℃灭活24h，期间每4h搅拌一次。接种鸡胚测定灭活效果：接种于9-11日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚接种0.1mL，置37℃孵育。24h照胚，非特异性死亡应不超过1枚。24h后每日照胚2次，观察5日。对所有胚液分别测定血凝价，均应不出现血凝。并盲传一代，测定血凝价，均应不出现血凝，则判定灭活完全。

    将四种灭活抗原（H9F6株、H9C1株、H9C2株、H9CD株），分别用灭菌生理盐水进行2倍稀释和4倍稀释，稀释后加入分别加入6%的吐温-80，充分混合后为水相，油相为白油。按照水相：油相为1:3的比例乳化制苗。

  （1）细胞灭活苗的制备

     按照05和06方法制备H9CD株细胞灭活疫苗。

  （2）胚毒灭活苗的制备

     将H9CD株用灭菌生理盐水稀释10^-4-10^-5，经尿囊液接种10-11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml。选择接种后48-120h内死亡鸡胚及120h存活鸡胚，置2-8℃冷却24h，收获鸡胚尿囊液，按照05方法进行灭活及灭活检验，按照06方法乳化制苗。

  （3）SPF鸡的免疫

     取21日龄SPF鸡，分为2组，每组5只，第一组免疫H9CD株细胞毒灭活疫苗，第二组免疫H9CD株灭活疫苗，0.2ml/只，另设空白对照组5只，不做免疫。分别在免疫后14日，21日采血分离血清，测定H9血清抗体效价。